Alternative Stammzellengenerierung

Öffentliche Bekanntmachung:	2007
Förderzeitraum:	2008 - 2011
Gesamtvolumen:	9,6 Mio. EUR
Vorhabenzahl:	29

Öffentliche Bekanntmachung:	2009
Förderzeitraum:	2010 - 2013
Gesamtvolumen:	6,1 Mio. EUR
Vorhabenzahl:	20

Verbundprojekt: Neurogenese aus Gehirn- und Hautzellen - neue Ansätze für eine neuronale Regeneration 

Verbundprojekt: Nabelschnurblut iPS-Bank

Verbundprojekt: neurohiPS - Derivate humaner neuraler Stammzellen: Von der Multipotenz zur Pluripotenz

Verbundprojekt: Reprogrammierung, Differenzierung und Sicherheitsanalyse induzierter pluripotenter Stammzellen durch innovative Technologien der Genommodifikation (ReGene) 

Verbundprojekt: Adulte Stammzellen humaner Schweißdrüsen

Verbundprojekt: Krankheitsspezifische induzierte pluripotente Stammzellen

Verbundprojekt: Podozyten aus adulten multipotenten Progenitorzellen

Verbundprojekt: "Evaluation von iPS-Zellen aus Parkinson Patienten"

Verbundprojekt: Induzierte pluripotente Stammzellen in Großtiermodellen

Verbundprojekt: Pluripotente Zellen in Hoden von Primaten

Verbundprojekt: Adulte menschliche Stammzelllinien mit definiertem Differenzierungspotenzial

Einzelvorhaben

1. Ziele des Förderschwerpunktes

Eine wachsende Zahl von Erkrankungen weltweit, v. a. in den alternden Gesellschaften der Industrienationen, beruht auf dem Verlust der Funktion von Zellen, Geweben oder Organen. Klassische Therapiemaßnahmen, wie die Gewebe- und Organtransplantation, bedürfen einer kontinuierlichen Behandlung der Patienten und sind durch die begrenzte Verfügbarkeit von Spenderorganen stark limitiert. Die Bereitstellung von Zell- und Gewebeersatz auf der Grundlage humaner Stammzellen könnte die Behandlungssituation für viele Patienten entscheidend verbessern. Grundlage für die Entwicklung neuer zellbasierter regenerativer Therapienansätze ist die Verfügbarkeit geeigneter, ethisch und rechtlich vertretbarer, Stammzellquellen.
Die Erforschung der molekularen und zellulären Grundlagen und Entwicklungspotenziale von Stammzellen hat sich in den letzten 25 Jahren zu einer dynamischen Disziplin mit hohem Interesse sowohl für die Grundlagenforschung als auch für anwendungsorientierte Fragestellungen entwickelt. Je näher die Ergebnisse der Forschung der klinischen Anwendung kommen, umso dringlicher wird der Bedarf an geeigneten Stammzellquellen. Daher besteht ein erhebliches Interesse an der Entwicklung von Verfahren zur Gewinnung multi- bzw. pluripotenter menschlicher Zellen, die mit dem Schutz menschlicher Embryonen kompatibel sind. Dies ist denkbar über die Nutzung von beim Menschen natürlich vorkommenden Stammzellen oder die Dedifferenzierung bzw. Reprogrammierung von adulten menschlichen Zellen. Aufgrund des hohen medizinischen Bedarfs unterstützt das Bundesministerium für Bildung und Forschung gezielt die Erschließung neuer menschlicher Stammzellquellen und die Identifizierung und Entwicklung von ethisch vertretbaren und rechtlich zulässigen Mechanismen und Methoden zur Generierung pluri- und multipotenter Zellen.

2. Stand der Fördermaßnahme

Im Herbst 2007 wurde in einer ersten öffentlichen Bekanntmachung zur Einreichung von Projektbeschreibungen eingeladen. Bis zum Ende der Einreichungsfrist am 15.01.2008 wurden Anträge für 44 Einzelprojekte und 23 Verbundprojekte - bestehend aus 79 Teilprojekten - vorgelegt. Im April 2008 erfolgte mit Hilfe eines international besetzten Gutachterkreises die Auswahl von 10 Einzelprojekten und 7 Verbünden. Diese haben ab Oktober 2008 mit der Arbeit begonnen.
Aufgrund der hohen Relevanz wurde die Bekanntmachung im Frühjahr 2009 erneut ausgeschrieben. Hierfür haben sich 43 neue Forschungsprojekte (20 Einzel- und 23 Verbundprojekte mit insgesamt 84 Teilprojekten) beworben. Mit Hilfe eines internationalen Gutachtergremiums erfolgte im Oktober 2009 die Auswahl der zu fördernden Projekte (4 Einzelprojekte und 5 Verbünde). Diese Projekte (bis auf 3 Teilprojekte) haben im Sommer 2010 die Arbeit aufgenommen.

3. Geförderte Vorhaben

a) Kurzbeschreibung der laufenden Vorhaben

(Sortierung innerhalb der Verbünde nach Förderkennzeichen)

Mechanismen der aktiven DNA Methylierung

Institut für Molekulare Biologie gGmbH Ackermannweg 4 55128 Mainz

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Christof Niehrs 06221 424693 01GN1101 94.070 EUR 01.07.2011 - 30.04.2012

Die Entwicklung von Stammzellen ist ein vielversprechender Ansatz für die regenerative Medizin. Eine Möglichkeit zur Gewinnung von Stammzellen ist die Reprogrammierung differenzierter, somatischer Zellen. Die epigenetische Regulation spielt bei der Reprogrammierung eine wichtige Rolle. Pluripotenzgene sind in somatischen Zellen durch DNA Methylierung inaktiviert. Im vorliegenden Projekt sollen Komponenten der Demethylierungsmaschinerie identifiziert werden, um die Reprogrammierung besser zu verstehen und ggf. gezielt zu befördern. Gadd45 spielt eine wichtige Rolle in der DNA Demethylierung. Mit Hilfe eines Proteomansatzes sollen interagierende Proteine von Gadd45 in Stammzellen durch Koimmunpräzipation identifiziert und charakterisiert werden.

Verbundprojekt: Neurogenese aus Gehirn- und Hautzellen - neue Ansätze für eine neuronale Regeneration

Neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson oder Alzheimer sind unheilbar, da sie mit einem permanenten Verlust von Neuronen verbunden sind, die nicht vom Organismus ersetzt werden können. Große Hoffnungen werden in stammzellbasierte Transplantationsstrategien gesetzt, die darauf abzielen, abgestorbene Neurone zu ersetzen. Dieser Ansatz hat jedoch nicht zu unterschätzende Hürden zu überwinden, da die Differenzierung der bisher genutzten Stammzellen sehr heterogen ist und das Überleben der transplantierten Zellen durch die heterologe, körperfremde Herkunft stark beeinträchtigt ist. Um diese Probleme zu überwinden, hat der Verbund einen neuartigen Ansatz gewählt: Es werden zellbiologische Strategien entwickelt, um (neuro)ektodermale Zellen des Patienten, Hautzellen aufgrund ihrer guten Zugänglichkeit sowie Gliazellen aus dem adulten Gehirn, direkt in Neurone zu reprogrammieren bzw. zu transdifferenzieren. Auf diese Weise sollen Therapien entwickelt werden, welche langfristig eine Reparatur durch patienteneigene Zellen ermöglichen.

Reprogrammierung von Astroglia in glutamaterge Nervenzellen (TP 1)

Ludwig-Maximilians-Universität München Institut für Physiologie Lehrstuhl für physiologische Genomik Schillerstr. 46 80336 München

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. Benedikt Berninger 089 2180-75208 01GN1009A 345609 EUR 01.06.2010 - 31.05.2013

Ziel des Teilprojekts an der LMU München ist die Generierung von spezifischen neuronalen Subtypen aus Astrozyten. Diese bilden aufgrund ihrer Verfügbarkeit im zentralen Nervensystem eine sehr erfolgversprechende Zellquelle für die Neubildung von abgestorbenen Neuronen. Nachdem die grundsätzliche Machbarkeit der Reprogrammierung von Astrozyten gezeigt worden ist, zielt das Teilprojekt nun darauf ab, 1) die Ausreifung der reprogrammierten Zellen zu Neuronen durch Herunterregulation von SOX2 zu verbessern; 2) das Potenzial des Transkriptionsfaktors TLX bei der Reprogrammierung von Astroglia zu bestimmen und 3) durch den zusätzlichen Einsatz von definierten Faktoren, kortikale Astroglia gezielt in spezifische Subtypen von Neuronen zu reprogrammieren, welche z. B. infolge eines Schlaganfalls o. a. zugrunde gegangen sind.

Transkriptionsfaktorvermittelte Transdifferenzierung somatischer Zellen in neurale Vorläuferzellen

Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Medizinische Fakultät und Universitätsklinikum Institut für Rekonstruktive Neurobiologie Sigmund-Freud-Str. 25 53127 Bonn

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. Frank Edenhofer 0228 6885-529 01GN1009B 233596 EUR 01.06.2010 - 31.05.2013

Ziel des Teilprojektes an der Universität Bonn ist es, verschiedene somatische Zellen mittels Überexpression ausgewählter Transkriptionsfaktoren direkt, durch gezielte Transdifferenzierung, in oligopotente neurale Vorläuferzellen umzuwandeln. Hierbei wird eine direkte Konversion der Zellen in den neuronalen Zelltyp angestrebt, ohne dabei einen pluripotenten Übergangszustand zu durchlaufen. Die entsprechenden Transkriptionsfaktoren werden mittels viraler Infektion bzw. Proteintransduktion in die Zielzellen eingebracht. Um die Transdifferenzierung direkt verfolgen zu können, werden virale Cre/loxP-Reporterkonstrukte entwickelt und in somatische Zellen eingebracht, die zuvor aus diversen neuralen Cre-Reportermauslinien isoliert werden.

Reprogrammierung von Astroglia in dopaminerge Neuronen (TP 2), Identifizierung von Transkriptionsfaktoren für die Reprogrammierung von adulten Zelle (TP 4)

Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Institut für Entwicklungsgenetik (IDG) Ingolstädter Landstr. 1 85764 Oberschleißheim

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Wolfgang Wurst 089 3187-4110 01GN1009C 540382 EUR 01.06.2010 - 31.05.2013

Folgende Untersuchungen sind im TP2 geplant: 1) Analyse der regionalen und zeitlichen Unterschiede im Expressionsprofil der Transkriptionsfaktoren in embryonalen radialen Gliazellen versus frühen postnatalen/adulten Astrogliazellen; 2) Testung der in 1) gefundenen Faktoren zusammen mit bereits bekannten TFs, in der in vitro-Reprogrammierung von postnataler/adulter Astroglia in mdDA-Neuronen (dopaminerge Neuronen des Mittelhirns und 3) Untersuchung der selektierten TFs in der in vivo-Reprogrammierung von postnataler/adulter Astroglia in mdDA-Neuronen im ventralen Mittelhirn und/oder Vorderhirn von transgenen Mäusen. In TP 4 werden folgende Untersuchungen durchgeführt: 1) Analyse, wie die Interaktion zwischen TLX und SOX 2 die Reprogrammierung von Astrozyten reguliert; 2) vergleichende Analyse des SOX 2-Interaktoms in adulten NSCs und in adulten Astrozyten um neue Reprogrammierungsfaktoren zu identifizieren und 3) Testung potenzieller Kandidaten in Reprogrammierungs-Assays in Astrozyten durch Partner des Verbundes.

Verbundprojekt: Nabelschnurblut iPS-Bank

Die Zellen des Nabelschnurblutes sind jung (besitzen lange Teleomere) und weisen eine geringe Zahl von Mutationen auf, die sich erst im Laufe der Zeit akkumulieren. Aus diesem Grund sind diese Zellen gut für regenerative Therapien geeignet. Aus Nabelschnurblutspenden werden adhärent wachsende Zellpopulationen gewonnen, bzw. nicht adhärent wachsende Zellen angereichert. Es werden die Ausgangszellpopulationen aus humanem Nabelschnurblut zur Reprogrammierung durch retrovirale, lentivirale und Protein-/Transduktionsbedingungen definiert. Anschließend werden iPS-Zellen aus humanem Nabelschnurblut mit Expressionsvektoren hergestellt. Weiterhin erfolgt die Generierung von iPS-Zellen aus humanem Nabelschnurblut mittels Proteintransduktion und niedermolekularen Substanzen. Generierte hiPS werden auf die Expression embryonaler Stammzellmarker untersucht. In embryonic bodies wird die Expression von endodermalen, ectodermalen und mesodermalen Markern analysiert. Die in vitro-Differenzierungen in Zellen des Mesoderms (Knochen, Knorpel, Fett) und des Endoderms (Leber) werden vergleichend zu den Ursprungszellen durchgeführt und analysiert. Zur Untersuchung der genomischen Integrität werden NB-abgeleitete iPSZ und aus adulten Fibroblasten gewonnene iPSZ in hochauflösenden SNP-Analysen verglichen. Zur Analyse der Funktionalität der etablierten iPSZ werden diese einer kontrollierten neuronalen Differenzierung mit nachfolgenden elektrophysiologischen Analysen unterzogen. Diese Studien werden durch eine vergleichende Untersuchung der mitochondrialen Funktion der gewonnenen iPSZ-abgeleiteten Neurone ergänzt. Aus Nabelschnurblut erzeugte iPS-Zellen werden unter verschiedenen Bedingungen kultiviert. Damit kann ein robustes Expansionsprotokoll entwickelt werden. Diese synchronisierten und standardisierten iPS-Zellen werden zur genauen funktionellen und molekulargenetischen Charakterisierung an die Verbundpartner weitergegeben.

Standardisierung von Subpopulationen von iPS (induzierten pluripotenten Stammzellen) mittels molekularer und funktioneller Kriterien und Koordinierung des Verbundes

Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Universitätsklinikum und Medizinische Fakultät Institut für Transplantationsdiagnostik und Zelltherapeutika (ITZ) Moorenstr. 5 40225 Düsseldorf

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Peter Wernet 0211 81-19544 01GN1008A 338.035 EUR 01.08.2010 - 31.07.2013

Vorhabensziel ist die Standardisierung von unterschiedlichen aus Nabelschnurblut erzeugten iPS-Zellpopulationen (CB-iPS) durch folgende experimentelle Ansätze: iPS-Zellkultivierung, Prüfung der iPS-Zell-Homogenität, CB-iPS MikroRNA-Profilierung, CB-iPS-Proteomcharakterisierung, CB-iPS-Epigenetische Daten-Überprüfung. Weiterhin erfolgen Koordinierungsaufgaben wie Auswertung und Datensammlung, zentrales iPS-Zellproben-Management, synchronisierte iPS-Zellverteilung an die anderen Konsortiumspartner, systematischer Aufbau einer CB-iPS-Bank, konform mit GMP-Verfahren und Arzneimittelrecht.

Technologieplattform zur Induktion pluripotenter Stammzellen (iPS) aus humanem Nabelschnurblut durch definierte Faktoren

Max-Planck-Institut für molekulare Biomedizin Röntgenstr. 20 48149 Münster

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Hans Schöler 0251 70365-300 01GN1008B 211.584 EUR 01.08.2010 - 31.07.2013

Es soll eine Technologieplattform zur Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS-Zellen) aus humanem Nabelschnurblut etabliert werden. Verschiedene Expressionssysteme für die Reprogrammierungsfaktoren (retroviral, lentiviral, episomal), niedermolekulare Substanzen („Small Molecules") und Kulturbedingungen werden hinsichtlich effizienter Generierung von iPS-Zellen aus verschiedenen Nabelschnurblutpopulationen (MSC, USSC, CD34+, Endothel, eingefroren sowie frisch isoliert) evaluiert. In Zusammenarbeit mit den Verbundpartnern werden die molekulare Signatur, Funktionalität und potenzielle klinische Verwendbarkeit dieser iPS-Zellen evaluiert.

Nabelschnurblut-Zielzellen zur Reprogrammierung

Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Medizinische Fakultät und Universitätsklinikum Institut für Rekonstruktive Neurobiologie Sigmund-Freud-Str. 25 53127 Bonn

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Oliver Brüstle 0228 287-6607 01GN1008C 399.158 EUR 01.08.2010 - 31.07.2013

Das Projekt zielt darauf ab, Zelltypen im Nabelschnurblut (NB) zu identifizieren, die sich in besonderer Weise für eine Reprogrammierung eignen. Darüber hinaus soll die genomische Integrität NB-abgeleiteter induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSZ) im Vergleich zu aus adulten Fibroblasten gewonnenen iPS-Zellen untersucht werden. In einem ersten Schritt wird die Reprogrammierungseffizienz für verschiedene NB-Zellpopulationen vergleichend untersucht. Daran schließen sich vergleichende Analysen der genomischen Integrität von NB-abgeleiteten und aus adulten Fibroblasten gewonnenen iPSZ an. Um die Fähigkeit von NB-abgeleiteten iPSZ zur vollen somatischen Differenzierung zu untersuchen, wird eine Plattform für die funktionelle Analyse iPSZ-abgeleiteter Neurone etablieren.

Isolierung, Generierung und Expansion von Zellsubpopulationen aus Nabelschnurblut und vergleichende Charakterisierung der daraus generierten humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS)

Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Universitätsklinikum und Medizinische Fakultät Institut für Transplantationsdiagnostik und Zelltherapeutika (ITZ) Moorenstr. 5 40225 Düsseldorf

Leiterin: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Gesine Kögler 0211 81-04342 01GN1008D 151.841 EUR 01.08.2010 - 31.07.2013

Ziel des Vorhabens ist die Isolierung, Generierung, Expansion und Charakterisierung verschiedener Zellsubpopulationen (unrestringierte somatische Stammzellen (USSC), "cord- blood derived" mesenchymale Stromazellen (CB-MSC), Endothelzellen, CD34+/CD45+Zellen und NK-Zellen) aus frischem und kryokonserviertem Nabelschnurblut zur Generierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS). Darüber hinaus sollen die von den Verbundpartnern generierten hiPS bezüglich ihres potenziellen Einsatzes bei regenerativen Therapien charakterisiert werden. Hinsichtlich ihres in vitro-Differenzierungspotenzials sollen vor allem USSC, CB-MSC und CD34+/CD45+Zellen mit den daraus generierten hiPS verglichen werden.

Verbundprojekt: neurohiPS - Derivate humaner neuraler Stammzellen: Von der Multipotenz zur Pluripotenz

Fetale und adulte neurale Stammzellen (NSZ) der Maus sind seit kurzem als priviligierte Zelltypen für Reprogrammierungsstrategien bekannt, da sie als einzig bekannte Zellquelle mit nur einem Reprogrammierungsfaktor induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) bilden können. Die Verwendung von fetalen humanen NSZ hat neben ethische Bedenken den Nachteil, nicht als patientenspezifisches (autologes) Therapiekonzept verwirklicht werden zu können. Das seit kurzem bekannt gewordene Vorhandensein von NSZ auch im adulten menschlichen Gehirn eröffnet hierfür neue Chancen. Das Gesamtziel des Projekts ist die Herstellung humaner iPS-Zellen ausgehend von adulten humanen NSZ aus der weißen Substanz bzw. des Hippocampusgewebes. Dieses Wissen könnte dazu dienen, um neue effektive und sichere autologe restaurative Therapiestrategien für Morbus Parkinson und andere neurodegenerative Erkrankungen zu entwickeln.

Isolation und Kultivierung von multipotenten, adulten humanen Neuralleisten-Stammzellen aus dem Palatum für autologe therapeutische Anwendungen (TP 1)

Universität Bielefeld Centrum für Biotechnologie Molekulare Neurobiologie Universitätsstr. 27 33615 Bielefeld

Leiterin: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Barbara Kaltschmidt 0521 106-5624 01GN1006A 248.594 EUR 01.06.2010 - 31.05.2013

In diesem Teilprojekt werden Neuralleisten-Stammzellen aus dem menschlichen Gaumen, einer leichtzugänglichen Gewebequelle, isoliert und charakterisiert. Besonderes Augenmerk wird dabei auf die Expression von Oberflächenmarkern zur Isolation und Konzentrierung der Zellen gelegt. Die erforderlichen Kulturbedingungen werden optimiert. Die Charakterisierung umfasst die Analyse von Pluripotenzfaktoren in Kultur, die Differenzierung in die drei Keimblätter sowie die Reprogrammierung. Dabei werden molekularbiologische und immunologische Methoden eingesetzt. Dieses Wissen könnte herangezogen werden, um neue effektive und sichere patientenspezifische restaurative Therapiestrategien für Morbus Parkinson und andere neurodegenerative Erkrankungen zu entwickeln.

Entwicklung und Charakterisierung von immuno-kompatiblen dopaminergen Vorläuferzellen für die Zellersatztherapie bei Parkinson Patienten (TP 2)

Ruhr-Universität Bochum Fakultät für Chemie und Biochemie Biochemie - Lehrstuhl für Molekulare Neurobiochemie Universitätsstr. 150 44801 Bochum

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Rolf Heumann 0234 32-28230 01GN1006B 193.618 EUR 01.09.2011 - 31.08.2013

Ziel ist es, charakterisierte Vorläuferzellen zu entwickeln, die sich bei Transplantation in dopaminerge Neurone differenzieren und funktionell integrieren ohne Tumore zu bilden. Zur Vermeidung der Tumorbildung soll die Methode der DNA-Transfektion durch die Einbringung von Transkriptionsfaktoren ersetzt werden, die das Genexpressionsmuster stabil regulieren. Die Herstellung der dopaminergen neuralen Vorläuferzellen wird in definierten Schritten ausgearbeitet. Die von den Projektpartnern erhaltenen induzierten Stammzellen werden zunächst überprüft. Durch Anwendung von extrazellulären Faktoren werden neurale Vorläufer erzeugt, die frühe neurale Vorläufercharakteristika aufweisen. Nach Verifizierung des Zelltyps wird eine schrittweise Induktion zum dopaminergen Vorläuferneuron mittels geeigneter Transkriptionsfaktoren vorgenommen. Neben der DNA-Transfektion sollen neue Methoden der Proteintransduktion zur Erzeugung der gewünschten Zelltypen erprobt werden. 

Neuroektodermale Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (TP 3)

Technische Universität Dresden Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus Klinik und Poliklinik für Neurologie Fetscher Str. 74 01307 Dresden

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Alexander Storch 0351 458-2532 01GN1006C 232.908 EUR 01.06.2010 - 31.05.2013

In diesem Teilprojekt sollen zunächst humane iPS-Zellen ausgehend von adulten humanen NSZ aus der weißen Substanz / Hippocampus durch OCT4-Expression generiert werden (entweder mittels virusvermittelter Überexpression oder durch Verwendung rekombinanter Proteine). Nachfolgend sollen in Kooperation mit dem Konsortium effiziente Protokolle zur neuroektodermalen Differenzierung dieser humanen iPS-Zellen entwickelt werden. Transplantationsstudien in Tiermodelle des Morbus Parkinson und des Morbus Huntington sollen dann deren neuroregeneratives Potenzial bestimmen.

Induktion pluripotenter Stammzellen aus humanen palatalen Stammzellen der Neuralleiste (TP 4)

Max-Planck-Institut für molekulare Biomedizin Röntgenstr. 20 48149 Münster

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Hans Schöler 0251 70365-300 01GN1006D 64.044 EUR 01.09.2011 - 31.08.2013

Im Rahmen dieses Projektes ist geplant, humane pNC-SCs oder neurale Stammzellen vom Hippocampus durch Expression von Oct4 oder Zugabe des Oct4 -Proteins in ein pluripotentes Stadium (induzierte pluripotente Stammzellen, iPS) zu reprogrammieren. 

Verbundprojekt: Reprogrammierung, Differenzierung und Sicherheitsanalyse induzierter pluripotenter Stammzellen durch innovative Technologien der Genommodifikation (ReGene)

Langfristiges Ziel des Verbundes ist die Entwicklung von gentechnischen Methoden zur Herstellung sicherer patientenspezifischer Stammzellen für die regenerative Medizin. Besonderes Augenmerk wird auf die Entwicklung klinisch akzeptabler Methoden gelegt.

Sleeping Beauty Transposition (TP 1)

Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Robert-Rössle-Str. 10 13125 Berlin

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. Zoltan Ivics 030 9406-2546 01GN1003A 278.333 EUR 01.07.2010 - 30.06.2013

Das Ziel dieses Teilprojektes ist die Etablierung und Evaluierung von Sleeping Beauty Transposon-vermittelter Gentransfertechnologien zur Herstellung von murinen und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). Es werden Sleeping Beauty Transposons mit Genen für die Neuprogrammierung, positive bzw. negative Selektionsmarker und Rekombinationsstellen hergestellt. Diese Transposonvektoren werden zusammen mit der hyperaktiven SB 100x Transposase, der zurzeit leistungsfähigsten Transposase, zum Einsatz kommen. Das Transposonsystem wird in murinen und humanen embryonalen Fibroblastenzellen transfiziert. Die iPS-Zellen werden dann selektiert und nach etablierten morphologischen und funktionalen Gesichtspunkten charakterisiert. Das Transposon wird dann durch folgende Methoden dauerhaft aus den hergestellten iPS-Zellen entfernt: 1) erneute Expression der SB 100x Transposase, welche das Transposon aus dem Genom herausschneidet und 2) rekombinations-vermitteltem Kassettenaustausch durch die vorübergehende Expression der Cre-Rekombinase. Mit dem Ziel, für den klinischen Einsatz geeignete, nicht-virale autologe Stammzelltherapien für die Anwendung bei Immundefizienzen zu etablieren, wird der Wirkungsgrad und die Sicherheit des Transposon-vermittelten stabilen Gentransfers kritisch ausgewertet werden.

Therapeutisches Modell (TP 2)

Medizinische Hochschule Hannover Abt. für Hämatologie Carl-Neuberg-Str. 1 30625 Hannover

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Christopher Baum 0511 532-5170 01GN1003B 233.596 EUR 01.07.2010 - 30.06.2013

Das Vorhaben nutzt Know-how in drei innovativen Technologien der gentechnischen Veränderung von Erbinformation: lentivirale Vektorsysteme, gezielte Genommodifikation durch Zinkfinger-Nukleasen (ZNF) und Rekombinase-vermittelter Kassettenaustausch (RMCE). Genetische und funktionelle Assays zur Untersuchung der Folgen von genetischen Veränderungen auf klonaler Ebene sind bereits entwickelt, fluoreszenzmarkierte Vektoren für die Herstellung von iPS-Zellen sind etabliert und validiert, und experimentelle Systeme zur hämatopoetischen Differenzierung von pluripotenten Zellen stehen zur Verfügung. Über die Zusammenarbeit mit den Konsortiumspartnern, werden folgende Ziele angestrebt: 1) die Herstellung von potenten Systemen für den sicheren, geregelten und reversiblen Transfer von Reprogrammierungskassetten zur Erzeugung von iPS-Zellen; 2) die gezielte Genommodifikation zur Integration sukzessiven Austausch von Expressionskassetten, welche induzierbare Differenzierung, konditionale Zellselektion und/oder einen therapeutischen Effekt vermitteln sowie 3) die Beurteilung des Einzelschicksals von Zellen im Rahmen der autologen Stammzelltherapie von Immundefekten.

Konditionale extrachromosomale Plasmide (TP 3)

Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Abt. Genvektoren (AGV) Marchioninistr. 25 81377 München

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Wolfgang Hammerschmidt 089 3187-1506 01GN1003C 154.548 EUR 01.07.2010 - 30.06.2013

Eine Reprogrammierung somatischer Zellen zu Stammzellen kann durch die Expression von bis zu vier Faktoren induziert werden. Diese Faktoren und ihre Expression in somatischen Zellen sind problematisch, da in der Regel chromosomal integrierende Vektoren verwandt werden, die zur Insertionsmutagenese und genetischen Instabilität in den transduzierten Zellen führen. In diesem Vorhaben wurden deshalb für die Expression dieser Faktoren nicht-integrierende, plasmidale Genvektoren entwickelt, deren Aufrechterhaltung durch niedermolekulare Verbindungen gesteuert werden kann. Das Projekt baut auf einer eigenen patentierten Technologie auf und möchte konditional regulierte Vektorplasmide konstruieren, testen und optimieren, die die Herstellung von in vitro reprogrammierten Stammzellen vereinfacht und sicherer macht. Ziel ist ein präklinisch umsetzbares Protokoll als Basis für eine autologe Stammzelltherapie bei Immunschwäche.

Verbundprojekt: Adulte Stammzellen humaner Schweißdrüsen

In vitro-Charakterisierung humaner Schweißdrüsenstammzellen (TP 1)

Fraunhofer-Einrichtung für Marine Biotechnologie (EMB) Paul-Ehrlich-Str. 1-3 23562 Lübeck

Leiterin: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. Sandra Danner 0451 38444-814 01GN1002A 284.788 EUR 01.06.2010 - 31.05.2013

Humane Schweißdrüsen stellen eine mögliche neue Quelle für multipotente Stammzellpopulationen dar. Der Fokus dieses Vorhabens liegt in der Weiterentwicklung der Isolationsmethode und der grundlegenden Charakterisierung dieser adulten Stammzellen. In der in vitro-Kultur weisen diese Zellen gute Proliferationseigenschaften auf, bilden das für adulte Stammzellen charakteristische Protein Nestin in hohem Maße und zeigen eine hohe Plastizität. Die Isolations- und Kultivierungsbedingungen sollen hier im Hinblick auf einen möglichen Einsatz für patientenspezifische (autologe) Zelltherapien optimiert werden. Die Aufgaben umfassen die Optimierung der Zellisolation aus humanen Hautbiopsien und der Kultivierungsbedingungen der gewonnenen adulten Stammzellpopulationen. Proliferations- und Wachstumscharakteristika der Zellen werden analysiert und ihr Expressionsprofil auf Gen- und Proteinebene untersucht. Desweiteren sollen in diesem Projekt Zellklone etabliert und die Differenzierungsfähigkeit der Stammzellen in verschiedene Zelltypen überprüft werden.

3D-Kultur humaner Schweißdrüsen-Stammzellen (TP 3) und in vivo-Anwendung dieser Zellen (TP 4)

Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Campus Lübeck - Klinik für Plastische Chirurgie Ratzeburger Allee 160 23562 Lübeck

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Peter Mailänder 0451 500-2061 01GN1002C 333.235 EUR 01.06.2010 - 31.05.2013

Glanduläre Stammzellen haben sich in jüngster Zeit zu einer vielversprechenden Quelle von multi/pluripotenten Stammzellen als ethisch vertretbare Alternative von embryonalen Stammzellen entwickelt. Großflächige Brandverletzungen mit weitreichender Zerstörung des Hautmantels und deren systemische lebensbedrohende Folgen stellen gegenwärtig ein ungelöstes Problem dar. Das Ziel der experimentellen Studie ist die Anwendung der gewonnenen multipotenten Schweißdrüsen-Stammzellen zur Hautregeneration im bereits etablierten Verbrennungs-Maus-Modell in vivo. Die Stammzellpopulationen der Schweißdrüsen, die einfach zugänglich den Patienten entnommen werden können, werden auf zwei verschiedenen Wegen angewendet. Zunächst erfolgt nach Durchführung einer tiefen Verbrühungsverletzung am Mausrücken die Injektion der generierten Stammzellen in die Stasezone der Verbrennung. Das Ziel ist, diese Gewebszone durch Einsprossung der umgewandelten Stammzellen in dermale Strukturen, zumindest teilweise retten zu können und so ein Nachtiefen und damit die Ausdehnung der Brandverletzung verringern zu können. Im zweiten Ansatz erfolgt die Untersuchung der dermalen Regeneration durch den Einsatz einer durch Stammzellen bioaktivierten Matrix im modifizierten Verbrennungsmodell.

Verbundprojekt: Krankheitsspezifische induzierte pluripotente Stammzellen

Neuro iPS (TP 3); Cardio iPS (TP 4); Protein iPS (TP 5)

Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Medizinische Fakultät und Universitätsklinikum Institut für Rekonstruktive Neurobiologie Sigmund-Freud-Str. 25 53127 Bonn

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. Oliver Brüstle 0228 287-6607 01GN0813 916.625 EUR 01.11.2008 - 31.12.2012

TP 3 untersucht Reprogrammierungs-assoziierte genetische und epigenetische Veränderungen in induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS). Das therapeutische Potenzial wird anhand krankheitsspezifischer iPS (metachromatische Leukodystrophie, MLD; TP 3) und iPS-abgeleiteter Herzmuskelzellen (TP 4) untersucht. Die Möglichkeit der Diagnose und Therapie von Herzerkrankungen in Zellkultur wird anhand krankheitsspezifischer iPS von Mausmodellen und Patienten untersucht. TP 5 analysiert nicht-invasive Methoden zur Herstellung Patienten-spezifischer pluripotenter Stammzellen. Ziel ist die Reprogrammierung humaner somatischer Zellen ohne genetische Modifikation zur uneingeschränkten Nutzung für therapeutische Anwendungen und als Krankheitsmodelle. Im TP 3 werden iPS aus hES-abgeleiteten neuralen Stammzellen hergestellt. Parallel werden kranheitsspezifische iPS von Patienten mit monogenetischen neurodegenerativen Erkrankungen generiert und die therapeutische Nutzbarkeit von iPS im Tiermodell der MLD evaluiert. TP 4 wird Herzmuskelzellen aus iPS gesunder Mäuse generieren und die Funktion mittels elektrophysiologischer Untersuchung sowie das therapeutische Potenzial durch Transplantation in Mäuse-Herzinfarkte analysieren. Ferner werden aus Mausmodellen und Patienten mit definierten Herzerkrankungen iPS generiert und pharmakologische Therapieversuche durchgeführt. TP 5 wird Protokolle zur Expression und Transduktion rekombinanter Reprogrammierungsfaktoren erarbeiten, die zusammen mit anderen TP die technische Plattform für nicht-virale Reprogrammierung bilden. Weiterhin werden reprogrammierende Transgene durch zellpermeable DNA-Rekombinasen aus iPS entfernt. Diagnose und Therapieversuch neurodegenerativer und kardiovaskulärer Erkrankungen von Patienten in Zellkultur ist ein neuer Ansatz einer individualisierten Behandlungsmethode.

Technologieplattform zur Induktion pluripotenter Stammzellen durch Transkriptionsfaktoren und kleine Moleküle (TP 1)

Max-Planck-Institut für molekulare Biomedizin Röntgenstr. 20 48149 Münster

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Hans Schöler 0251 70365-30 01GN0811 467.670 EUR 01.11.2008 - 31.10.2012

Das Konsortium will die “iPS-Reprogrammierungs-Technologie” weiterentwickeln, um krankheitsspezifische induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) zu generieren. Ziel von Teilprojekt 1 ist die Entwicklung der Technologieplattform zur Reprogrammierung somatischer (differenzierter) Zellen der Maus und des Menschen mit definierten Transkriptionsfaktoren und kleinen Molekülen sowie die Evaluierung der Funktionalität und Verwendbarkeit dieser Technologie für die Entwicklung von Krankheitsmodellen in Kooperation mit den verschiedenen Partnergruppen (Teilprojekte 2 - 5) dieses Verbundes. Funktionelle murine und humane iPS sollen mit den gegenwärtigen Vektoren generiert und zur Verfügung gestellt und die Verwendung weiterer Vektorsysteme evaluiert werden. Kleine Moleküle/niedermolekulare Substanzen sollen zusammen oder anstelle von Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog oder anderen Kandidatengenen im Prozess der Generierung von iPS-Zellen evaluiert werden. Die Möglichkeit, den Verlauf einer Erkrankung eines Patienten mit genetischen und epigenetischen Veränderungen von iPS-abgeleiteteten Zellen in vitro zu vergleichen, ist ein völlig neuer Ansatz für individualisierte Behandlungsmethoden. Zukünftig könnten iPS-Banken aufgebaut werden, in denen gut charakterisierte iPS-Zellen aufgenommen werden, die verschiedene Krankheitsmodelle repräsentieren.

Verbundprojekt: Podozyten aus adulten multipotenten Progenitorzellen

Chronische Nierenerkrankungen sind von großer medizinischer und gesundheitsökonomischer Bedeutung für die Industrienationen. Der voranschreitende Verlust der Nierenfunktion, welcher schließlich im chronischen Nierenversagen endet, ist zurzeit mit therapeutischen Mitteln kaum zu stoppen. Ziel des Konsortiums ist es, die molekularen Mechanismen, welche für die Erneuerung von Podozyten, terminal differenzierter Zellen des Nierenkörperchens, aus multipotenten Vorläuferzellen der Niere verantwortlich sind, zu entschlüsseln, um diese für die Entwicklung von zellbasierten Regenerationsverfahren für die Behandlung von chronischen Nierenerkrankungen zu nutzen.

Bioinformatik/Netzwerkanalysen (TP 3)

Universität Rostock Institut für Medizinische Informatik und Biometrie Rembrandtstr. 16-17 18055 Rostock

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Georg Füllen 0381 494-7360 01GN0901 159.454 EUR 01.02.2009 - 31.08.2012

Der Differenzierungsprozess von adulten multipotenten Progenitorzellen (APEMPs) in Podozyten wird - basierend auf Microarray-Transkriptom-Analysen, die in den Kontext der bekannten Protein-Interaktionen (PIs) und transkriptionellen Regulationen (TRs) eingebunden werden - in silico nachvollzogen. PIs und TRs werden aus Datenbanken, Publikationen und Genomdaten extrahiert. PIs werden in einem Expertennetzwerk abgebildet und mit öffentlich verfügbaren Daten erweitert (STRING, Biogrid, KEGG, GlomNet). TRs werden teilweise aus einer High-Throughput-Pipeline abgeleitet, die auf ReXSpecies basiert. Diese wurde entwickelt um hoch zuverlässige Module von Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen zu identifizieren, die unterschiedliche Come-And-Go-Pattern in der Spezieshierarchie aufweisen. Daten des PI- und TR-Netzwerks werden für die Interpretation des Transkriptoms der isolierten Zellen und Zelllinien in unterschiedlichen Stadien der Differenzierung eingesetzt. Gleichzeitig wird auch das Netzwerk durch die beobachteten transkriptionellen Veränderungen verbessert und erweitert. Mithilfe des Netzwerkes werden "intervention points" wie z. B. Masterregulatoren identifiziert. Um "small molecules", die mit Masterregulatoren interagieren, vorherzusagen, wird die RiPE-Pipeline so angepasst, dass unter Verwendung einer Genhierarchie, die mit funktionellen Daten annotiert ist, "guilt by association"-Vorhersagen getroffen werden können. Die besten Vorhersagen werden in Laborexperimenten getestet und die Ergebnisse werden in das bioinformatische Analyseverfahren rückgekoppelt.

Zellanalysen (TP 2)

Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald Medizinische Fakultät Institut für Anatomie und Zellbiologie Friedrich-Loeffler-Str. 23c 17489 Greifswald

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Karlhans Endlich 03834 86-5300 01GN0805 356.879 EUR 01.11.2008 - 30.06.2012

Parietale Epithelzellen (PECs) enthalten adulte multipotente Progenitorzellen (APEMPs). Es konnte jüngst nachgewiesen werden, dass Podozyten durch PECs nachgebildet werden können. Die molekularen Mechanismen der Differenzierung von APEMPs in Podozyten zu verstehen, ist das Ziel des Teilprojektes, um damit das notwendige Grundlagenwissen für die Entwicklung von neuen Therapeutika für die Behandlung der chronischen Nierenkrankheit zu generieren. Aus der Niere der transgenen Mäuse werden durch Isolation der Glomeruli, enzymatischen Verdauung und Verwendung von Durchflusszytometrie mit Fluoreszenzsortierung mit dem Grünen Fluoreszenzprotein (GFP) markierte Podozyten bzw. GFP-markierte PECs, welche die APEMPs enthalten, isoliert. Das Transkriptom dieser reinen Zellpopulationen wird mittels Microarray-Analyse bestimmt. Zelllinien von Podozyten, PECs und APEMPs werden umfassend charakterisiert; ebenso wird das Transkriptom dieser Zelllinien bestimmt. Damit stehen gut definierte Zellkultur-Modelle zur experimentellen Untersuchung und Manipulation der Differenzierung zur Verfügung. Die Zelllinien werden benutzt, um zu untersuchen, ob externe Faktoren (extrazelluläre Matrix, mechanische Kräfte, Hormone) die Differenzierung von APEMP in Podozyten steuern. Des Weiteren werden gezielt in silico identifizierte Masterregulatoren der Differenzierung manipuliert, z. B. durch die Verwendung von "small molecules". Die Differenzierung wird durch Bestimmung der Expression von Differenzierungsmarkern und durch Transkriptom-Analyse beurteilt. Die Expression von Masterregulatoren und von Differenzierungsmarkern wird außerdem an Nierengewebe mittels Immunhistochemie verifiziert.

Tiermodelle und Zelllinien (TP 1)

Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen Fakultät 10 - Medizin und Universitätsklinikum Medizinische Klinik II Nephrologie und Klinische Immunologie Pauwelsstr. 30 52074 Aachen

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

PD Dr. Marcus Möller 0241 80 35204 01GN0804 391.503 EUR 01.11.2008 - 30.04.2012

Aus transgenen Mauslinien werden weitere Mauslinien generiert, in denen parietale Epithelzellen (PECs) bzw. Podozyten spezifisch und irreversibel mit dem grünen Fluoreszenzprotein (GFP) markiert sind. Die gewünschten Zellpopulationen werden aus diesen Tieren isoliert, um ihr Transkriptom zu bestimmen und zu analysieren und um Zellkulturen dieser Zellpopulationen zu etablieren. Zusätzlich werden konditional immortalisierte Zelllinien generiert. Die Multipotenz von Kulturen der adulten parietalen epithelialen multipotenten Progenitorzellen (APEMPs) wird zunächst verifiziert. Um den Differenzierungsprozess in Zellkultur zu verfolgen, wird ein Reportergen mittels lentiviraler Transduktion stabil in die Zellen eingeschleust. Bei dem Reportergen handelt es sich um die sezernierte Form der alkalischen Phosphatase (SEAP), deren Expression durch den podozytenspezifischen Podocin-Promoter getrieben wird. Die Aktivität spezifischer Signalwege der Differenzierung - teilweise vorhergesagt durch die in silico-Analyse - wird in kultivierten APEMPs manipuliert, um die Effekte auf die Proliferation, Migration und Differenzierung in Podozyten zu untersuchen. Substanzen, die aufgrund der in silico und in vitro-Analyse Kandidaten für eine Beschleunigung der glomerulären Regeneration sind, werden im transgenen Tiermodell (Tiermodell mit markierten PECs bzw. Podozyten) getestet.

Verbundprojekt: "Evaluation von iPS-Zellen aus Parkinson Patienten"

Funktionalitäts-Test neuronaler Transplantate (TP 2), Immunogenität von iPS-Zellen (TP 3)

Georg-August-Universität Göttingen Universitätsklinikum und Medizinische Fakultät Zentrum Neurologische Medizin Klinische Neurophysiologie Robert-Koch-Str. 40 37075 Göttingen

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Walter Paulus 0551 39-6650 01GN0819 272.158 EUR 01.11.2008 - 30.04.2012

Die funktionellen Eigenschaften von induziert pluripotenten Stammzellen (iPS) aus normalen Individuen und an Morbus Parkinson leidenden Patienten sollen mit humanen embryonalen Stammzellen (ES) verglichen werden. Die Pluripotenz der generierten iPS-Zellen soll nachgewiesen werden. Die aus iPS-Zelllinien differenzierten neuronale Vorläuferzellen (NP) und dopaminerge (DA) Neurone sollen durch Transplantationsversuche in das Striatum von 6-Hydroxy-Dopamin-(6-OHDA)-läsionierte Ratten untersucht werden. Zum Vergleich sollen NP und DA-Neurone aus humanen ES-Zellen eingesetzt werden. Da die Immunantwort des Empfängers das Überleben und die Funktion der transplantierten Zellen beeinträchtigen kann und die Transplantation mit dem Risiko der Teratomentwicklung behaftet ist, sofern pluripotente Zellen das Transplantat kontaminieren, ist es außerdem notwendig die Immunogenität und Tumorigenität der transplantierten Zellen zu untersuchen. Folgende Arbeitspakete sind geplant: Die Expressionsprofile immunologisch relevanter Zelloberflächenmoleküle auf ES- und iPS-Zellen sowie auf NP und DA Neuronen sowie die Suszeptibilität dieser Zellen gegenüber zytotoxischen Immunmechanismen wird untersucht. Die Pluripotenz der Zellen wird in immundefizienten Mäusen durch Teratom-Wachstums-Tests überprüft. Die humanen in vitro differenzierten DA-Neurone werden unter Nutzung des Ratten-Models des M. Parkinson transplantiert und funktionell durch eine differenzierte Batterie von Verhaltenstests getestet. Die Immunogenität und Tumorigenität dieser Transplantate wird überprüft.

Teilprojekt 1

Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie Abt. Molekulare Zellbiologie/Keimzellentwicklung Am Faßberg 11 37077 Göttingen

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Ahmed Mansouri 0551 201-1490 01GN0818 371.722 EUR 01.11.2008 - 30.04.2012

Ziel ist es, induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) aus normalen und Parkinson Patienten zu etablieren. Das Potenzial von solchen iPS und humanen embryonalen Stammzellen (h-ES) dopaminerge (DA) Neurone zu generieren soll verglichen werden. Wir planen retrovirale und nicht retrovirale Vektoren zu verwenden, um die Expression der vier Faktoren zur Induktion von iPS-Zellen aus humanen Fibroblasten zu erzielen. Neuronale Vorläuferzellen (NP) und DA-Neurone aus iPS und h-ES-Zellen sollen mit verschiedenen Ansätzen, wie der Ermittlung von Expressionsprofilen und Transplantationsexperimenten verglichen werden. (Versuche mit h-ES-Zellen werden nach erfolgter Genehmigung durch das RKI durchgeführt.) Folgende Arbeitspakete sind geplant: 1. Gewinnung von iPS-Zellen aus Hautzellen von gesunden Probanden und Parkinson Patienten (PD). 2. Herstellung von neuronalen Vorläuferzellen (NP) und dopaminerge (DA) Neuronen aus iPS und humanen embryonalen Stammzellen (h-ES). 3. Erstellen von Expressionsprofilen. 4. Generierung von iPS-Zellen anhand nicht-viraler Konstrukte. 5. NP und DA Neurone aus h-ES und iPS-Zellen für die Transplantation. Eine Weiterentwicklung der Produktionsbedingungen von geeigneten kultivierten Zellen (iPS Zellen ohne virale Vektoren) für die Zellersatztherapie wird im großen Maßstab für klinische Studien, gemeinsam mit universitären oder industriellen Kooperationspartnern angestrebt. Die Entwicklung von neuroprotektiven Faktoren für die Therapie von Parkinson aus der Transkriptomanalyse wird angestrebt.

Verbundprojekt: Induzierte pluripotente Stammzellen in Großtiermodellen

Weißbüschelaffe - Morbus Parkinson

Deutsches Primatenzentrum Gesellschaft mit beschränkter Haftung Leibniz-Institut für Primatenforschung Abt. Stammzellbiologie Kellnerweg 4 37077 Göttingen

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

PD Dr. Rüdiger Behr 0551 3851-132 01GN0817 251.416 EUR 01.11.2008 - 31.10.2012

Im Rahmen dieses Teilprojektes sollen induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) des Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) generiert werden. Dabei sollen sogenannte episomale Vektoren genutzt werden, die nicht wie die herkömmlichen viralen Vektoren in das zelluläre Genom integrieren und somit nicht potenziell mutagen sind. Nach Etablierung und Charakterisierung der iPS-Zellen sollen diese in vitro gezielt zu dopaminergen Neuronen differenziert werden, um langfristig in einem etablierten Weißbüschelaffen-Modell für die neurodegenerative Erkrankung Morbus Parkinson auf ihre Anwendbarkeit im Rahmen einer Zellersatztherapie hin überprüft zu werden. Ziel ist also, Nutzungsmöglichkeiten einer Zellersatztherapie mit Hilfe von iPS-Zellen in einem sehr relevanten präklinischen nicht-humanen Primatenmodell für Morbus Parkinson zu erkunden. Der Arbeitsplan umfasst die folgenden Schritte: 1) Konstruktion der episomalen Marmoset-Vektoren; 2) Transfektion der Fibroblasten und iPS-Zell-Etablierung vom Weißbüschelaffen; 3) Charakterisierung der Weißbüschelaffen-iPS-Zellen; 4) Differenzierung in dopaminerge Neurone und autologe subkutane Transplantation - Test auf iImmunologische Abstoßung und Tumorigenizität; 5) Autologe Transplantation in Weißbüschelaffen-Parkinson-Modell.

Rhesus-Affe-Kardiomyocyten, Pneumozyten

Medizinische Hochschule Hannover Leibniz Forschungslaboratorien für Biotechnologie und künstliche Organe (LEBAO) Podbielskistr. 380 30659 Hannover

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Ulrich Martin 0511 532-8820 01GN0816 214.989 EUR 01.11.2008 - 31.07.2012

Ziel des Vorhabens ist die Generierung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Rhesus-Affen (RhiPS) sowie deren Charakterisierung im Hinblick auf ihr mesendodermales Differenzierungspotenzial. Das Arbeitsprogramm umfasst: 1) Entwicklung und Produktion viraler, insbesondere lentiviraler, Vektoren, (Selektionsvektoren - Expression von GFP-PuroR unter Kontrolle des humanen Oct3/4 Promotors sowie Vektoren zur Expression von humanen Pluripotenzfaktoren), Isolierung von primären Fibroblasten und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) vom Rhesusaffen, Primärzellkultur, Optimierung der Transduktion von Rhesusaffen Fibroblasten und MSCs. 2) Etablierung von RhiPS, Transduktion von Fibroblasten und MSCs mit Selektionsvektoren und Kombinationen von lentiviralen Vektoren zur Expression von humanen Pluripotenzfaktoren. 3) Charakterisierung von undifferenzierten RhiPS, Bisulfitsequenzierung zur Analyse des Methylierungsmusters von relevanten endogenen Promotorsequenzen, Expressionsanalyse von pluripotenzassoziierten Genen. 4a) Kardiale Differenzierung von RhiPS,Transduktion von iPS mit lentiviralen Vektoren zur kardiomyozytenspezifischen Selektion, Differenzierung von iPS zu Kardiomyozyten und deren Charakterisierung. 4b) Differenzierung von RhiPS zu Typ II Pneumozyten (AT2), Transduktion von iPS mit lentiviralen Vektoren zur AT2-spezifischen Selektion, Differenzierung von iPS zu AT2 und deren Charakterisierung. Das Projekt zielt in erster Linie auf einen Erkenntnisgewinn im Hinblick auf eine klinische Anwendung humaner iPS-Zellen (huiPS). Im Gegensatz zu huiPS-Zellen können Derivate von RhiPS in autologen Großtiermodellen transplantiert werden und damit wichtige Erkenntnisse für erste klinische Anwendungen huiPS-Zellen liefern. Aus dem Projekt hervorgehende methodische Entwicklungen sollten in der Regel auch für huiPS nutzbar sein.

Weißbüschelaffe-Hämatopoese

Universität Duisburg-Essen Universitätsklinikum Essen Institut für Transfusionsmedizin Hufelandstr. 55 45147 Essen

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Peter Horn 0201 723-1550 01GN0815 206.988 EUR 01.11.2008 - 31.07.2012

Im Rahmen des Vorhabens sollen induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) des Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) mittels gammaretro- oder foamyviralen Gentransfers generiert werden. Nach Etablierung und detaillierter Charakterisierung sollen die iPS-Zellen in vitro gezielt zu hämatopoetischen Vorläuferzellen differenziert werden, um diese dann zunächst in einem Maustransplantationsmodell und langfristig auch in einem autologen Transplantationsmodell auf ihre Anwendbarkeit im Rahmen einer hämatopoetischen Zellersatztherapie hin zu überprüfen. Ziel dieses Teilprojektes ist es, Nutzungsmöglichkeiten einer neuen Quelle für hämatopoetische Stammzellen in einem klinisch relevanten nicht-humanen Primatenmodell zu erkunden. Der Arbeitsplan sieht die folgenden Schritte vor: 1. Konstruktion der gamma- und foamyviralen Vektoren, die die humanen Sequenzen oder die Weißbüschelaffen-Homologe der bei Mensch und Maus zur iPS-Zell-Generierung verwendeten Gene (Oct3/4, Sox2, Klf4, c.Myc, Nanog, Lin28) beinhalten; 2. iPS-Zell-Etablierung vom Weißbüschelaffen mittels Transduktion von Fibroblasten aus der Haut und aus dem Knochenmark; 3. Charakterisierung der Weißbüschelaffen-iPS-Zellen (Markergene, DNA-Methylierunsanalyse, Teratombildungsassay, Embryoid body formation); 4. Differenzierung von iPS-Zellen in frühe hämatopoetische Progenitoren und in vitro-Charakterisierung dieser Zellen; 5. Transplantation von iPS-Zellen in einem NOD/SCID Mausmodell und ggf. in einem autologen Transplantationsmodell.

Miniaturschweine-Kardiomyozyten

Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Institut für Nutztiergenetik Höltystr. 10 31535 Neustadt am Rübenberge

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Heiner Niemann 05034 871-148 01GN0814 222.202 EUR 01.11.2008 - 31.07.2012

Ziel ist es, Schweine-iPS (induzierte pluripotente Stammzellen) durch Reprogrammierung von Fibroblasten mit Hilfe episomaler Vektoren abzuleiten, im Detail zu charakterisieren und aus iPS differenzierte Kardiomyozyten in einem Infarktmodell beim Schwein einzusetzen. Zunächst werden hierfür iPS aus Schweine-Fibroblasten mit Hilfe des etablierten Protokolls unter Nutzung retroviraler Vektoren und der vier bekannten Transkriptionsfaktoren OCT4, SOX2, KlF4 und c-MYC abgeleitet. Parallel dazu werden episomale (nicht-virale) Vektoren und lentivirale Vektoren für die Reprogrammierung eingesetzt. Die erhaltenen iPS werden anhand der Expression von Pluripotenzgenen, dem Wachstumspotenzial in vitro, der mitotischen und chromosomalen Stabilität, dem Methylierungsstatus der DNA, der Fähigkeit zur gezielten und spontanen Differenzierung, sowie der Teratombildung charakterisiert. Aus iPS abgeleitete Kardiomyozyten werden in einem etablierten Schweinemodell zur Prüfung der myokardialen Regeneration eingesetzt. Es werden Tiere verwendet, die aus den Populationen, aus denen die iPS-Zellen abgeleitet werden, durch somatisches Klonen produziert sind. Damit können die Effekte einer syngenen Zelltherapie in optimierter Weise untersucht werden. Das Schwein ist hervorragend geeignet, therapeutische Anwendungsmodelle für den Menschen zu prüfen. Durch die Verwendung des Klonmodells sind weltweit erstmals Erkenntnisse im Hinblick auf den Einsatz neuartiger zellulärer Therapien beim Menschen zu erwarten. Ferner erwarten wir, dass mit der erfolgreichen Etablierung von iPS-Zellen auch wesentliche Erkenntnisse über die Ableitung echter embryonaler Stammzellen beim Schwein gelingen. Solche echten embryonalen Stammzellen sind bisher nur bei der Maus, mit Abstrichen beim Menschen bekannt.

Verbundprojekt: Pluripotente Zellen in Hoden von Primaten

Ziel des Forschungsverbundes ist die Identifizierung von pluripotenten Stammzellen im fetalen, neonatalen und adulten Hoden und die Entschlüsselung der graduellen Entwicklung von der prinzipiell pluripotenten Primordialkeimzelle zur unipotenten Spermatogonie. Aufgrund der starken Ähnlichkeit der Spermatogenese der Primaten mit der des Menschen werden im Verbund Makaken und Weißbüschelaffen neben menschlichen Gewebeproben von Hodenkrebspatienten für die Untersuchungen genutzt. Vorrangige Fragestellungen sind, ob und wann Hodenzellen während der Entwicklung ihre Pluripotenz verlieren, welche Populationen von Zellen während der Differenzierung entstehen und ob das Potenzial zur Pluripotenz in den testikulären Stammzellen und den Vorläuferzellen von Hodenkrebs beim Menschen erhalten bleibt. Die beiden Arbeitsgruppen des Verbundes nutzen hierfür unterschiedliche Modellsysteme und methodische Ansätze. Das im Verbund generierte detaillierte Verständnis der Differenzierungsprozesse im Primatenhoden wird dazu beitragen die Isolierung und in vitro Kultivierung von pluripotenten Hodenstammzellen zu optimieren und für die Entwicklung neuer diagnostischer und regenerativer medizinischer Verfahren nutzbar zu machen.

Weißbüschelaffe

Deutsches Primatenzentrum GmbH Leibniz-Institut für Primatenforschung Abt. Stammzellbiologie Kellnerweg 4 37077 Göttingen

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

PD Dr. Rüdiger Behr 0551 3851-132 01GN0810 242.516 EUR 01.02.2009 - 31.10.2012

Ziel des Teilprojektes 2 ist die funktionelle Untersuchung der Differenzierungsprozesse von Keimzellen im Weißbüschelaffen. Hoden von Affen unterschiedlichen Alters (fetal bis adult) werden für die Zell-Isolierung und Kultivierung und zur Gewinnung histologischer Proben verwendet. Immunhistochemische Nachweise zur Charakterisierung von pluripotenten Stammzellen sind etabliert und werden unter Verwendung etablierter Antikörper an Gewebeschnitten durchgeführt. Magnetische Zellseparation und Durchflusszytometrie werden zur Anreicherung von Keimzellen vor der Kultivierung und zur Charakterisierung der Zellen nach Isolierung und/oder Kultivierung genutzt. Teratom-Bildungsassys sowie Transplantationsassays werden zur funktionellen Analyse der Keimzellen verwendet. Nach Abschluss des Projektes soll einschätzbar sein, in welchen Entwicklungsstadien die männlichen Keimzellen des Weißbüschelaffen welche Entwicklungspotenz haben oder möglicherweise wieder erlangen können. Die Arbeitsplanung umfasst: 1) Analyse der Stamm- und Keimzellmarkerexpression in situ zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Hodenentwicklung; 2) Isolierung der Zellen aus den Hoden zu den respektiven Zeitpunkten; 3) Kultivierung der Zellen und Analyse der Stamm- und Keimzellmarkerexpression; 4) Funktionelle Analyse der Zellen mittels dreier unterschiedlicher Assays; 5) Präsentation und Publikation der Ergebnisse.

Verbundprojekt: Adulte menschliche Stammzelllinien mit definiertem Differenzierungspotenzial

Zellcharakterisierung

Forschungszentrum für Regenerative Therapien Dresden (CRTD) der Technischen Universität Dresden Biotechnologisches Zentrum Tatzberg 47-49 01307 Dresden

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Gerd Kempermann 0351 46340086 01GN0803 173.951 EUR 01.02.2009 - 31.03.2013

Das Ziel ist menschliche Stammzelllinien zu erhalten, die Stammzellen im engeren Sinne der Definition enthalten und in den korrekten neuronalen Phänotyp differenzieren. Das Projekt wird vervollständigt durch Untersuchungen über die genetischen Grundlagen der Stammzellaktivität bei Epilepsie, insbesondere im Hinblick auf kognitive Parameter, und über jene Charakteristika, die das Potenzial adulter neuraler hippocampaler Stammzellen ausmachen. Das Gesamtprojekt wird an zwei Standorten (Teilprojekt 1 in Bielefeld und 2 in Dresden) durchgeführt. In Teilprojekt 1 werden die Zellkulturen hergestellt und nach Dresden überführt, wo sie in Teilprojekt 2 charakterisiert und in Bezug zu klinischen Daten gesetzt werden.

Zellisolation

Krankenhaus Mara gGmbH Epilepsiezentrum Bethel Epilepsiekliniken - Abt. Prächirurgische Diagnostik und Epilepsiechirurgie Maraweg 21 33617 Bielefeld

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. Alois Ebner 0521 772-78870 01GN0802 248.228 EUR 01.02.2009 - 31.07.2012

Das erwachsene Gehirn enthält Stammzellen, die physiologischerweise zur normalen Hirnfunktion beitragen und die im Rahmen einer Reihe von Erkrankungen wie Demenzen, Epilepsie oder Depression, Fehlfunktionen zu zeigen scheinen. Stammzelllinien aus dem Gehirn erwachsener Menschen stellen ein sehr nützliches Werkzeug dar, um pharmakologische und andere Strategien zur Behandlung neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen zu verbessern, bei denen die gezielte Modulation der zellulären Plastizität (Anpassungsvorgänge), inklusive der Bildung neuer Nervenzellen (adulte Neurogenese) ein Ziel ist. Stammzellen kommen im erwachsenen menschlichen Hippocampus vor, wurden aber noch kaum charakterisiert und definierte Zelllinien existieren nicht. In diesem Projekt werden genetisch unterschiedliche neurale Stammzelllinien aus menschlichen Hippocampi, die im Rahmen eines epilepsiechirurgischen Eingriffs entfernt wurden, hergestellt. Es werden in der Maus erprobte Protokolle für Stammzellkulturen angewendet und angepasst, um menschliche Stammzelllinien zu erhalten, die Stammzellen im engeren Sinne der Definition enthalten.

 

Einzelvorhaben:

Erstellung und Korrektur Patienten-spezifischer iPS-Zellen zur Therapie der Septischen Granulomatose (CGD)

Technische Universität Dresden DFG-Forschungszentrum für Regenerative Therapien Dresden (CRTD) Tatzberg 47/49 01307 Dresden

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. Konstantinos Anastassiadis 0351 463-40127 01GN1007 462.693 EUR 01.06.2010 - 31.05.2013

Das Vorhaben befasst sich mit der Etablierung von Methoden für die Erstellung von induzierbaren pluripotenten Stammzellen (iPS) von Patienten mit X-chromosomaler Septischer Granulomatose (X-CGD). Ziel des Vorhabens ist die Etablierung einer Reprogrammierung durch Einschleusung notwendiger Reprogrammierungsfaktoren mittels piggyBac Transposon und/oder mRNA-Transfektion durch die es nicht zu Modifikationen des Genoms kommt. Die der X-CGD zugrunde liegende Mutation wird durch homologe Rekombination (gene targeting) in den iPS-Zellen berichtigt und die korrigierten Zellen sodann in hämatopoetische Stammzellen differenziert. Für die Reprogrammierung somatischer Zellen von X-CGD-Patienten in iPS-Zellen werden kombinierte Methoden aus piggyBAC Transposon-Vektoren und mRNA-Transfektion verwendet und optimiert. Die Korrektur des genetischen Defektes erfolgt mittels homologer Rekombination. Die korrigierten iPS-Zellen werden in vitro in hämatopoetische Zellen differenziert und funktionell analysiert. Die in vivo-Funktionalität der korrigierten differenzierten Zellen wird mittels Transplantation an Mausmodellen untersucht.

Untersuchung der Chromosomeninstabilität, abnormaler Zellzyklus-Checkpoints, Alterung und deren Einfluss auf die Induktion von Pluripotenz

Max-Planck-Institut für molekulare Genetik Ihnestr. 63-73 14195 Berlin

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. James Adjaye 030 8413-1203 01GN1005 275.394 EUR 01.08.2010 - 31.07.2013

In dem Vorhaben soll der Einfluss des Alters und altersbedingter molekularer Veränderungen auf die Reprogrammierbarkeit von Zellen und die Herstellung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS) untersucht werden. Die in dem Vorhaben erzielten Ergebnisse dienen der Bereitstellung alternativer, anwendungsgeeigneter Stammzellquellen und der Entwicklung von Methoden für die regenerative Medizin, in welcher die Behandlung altersbedingter degenerativer Erkrankungen eine sehr große Rolle spielt. Hierfür sollen folgende Fragen beantwortet werden: 1. Können somatische Zellen von alten Menschen mit gleicher Effizienz wie die von jungen Menschen in den pluripotenten Zustand versetzt, d. h. reprogrammiert werden? 2. Werden allgemeine Eigenschaften des Alters in diesen reprogrammierten iPS-Zellen fortbestehen? 3. Kann die Reprogrammierung alter Zellen durch den Zusatz von Wirkstoffen verbessert werden, ggf. indem allgemeine zelluläre Mechanismen beeinflusst werden, die mit dem Alterungsprozess assoziiert sind? 4. Chromosomale Instabilität und verkürzte Telomere sind Eigenschaften des Alterungsprozesses, deshalb sollen iPS-Zellen von Patienten mit Nijmegen-Bruch-Syndrom, einer Erkrankung die auf chromosomale Instabilität begünstigenden Mutationen beruht, erzeugt werden, um sowohl die Krankheit als auch den Einfluss der zellulären Anomalien auf die Reprogrammierung besser zu verstehen; 5. Das Erschließen von Fruchtwasserzellen als eine alternative Zellquelle für die Herstellung von iPS-Zellen für die regenerative Medizin.

Einsatz von in vitro transkribierter RNA zur Reprogrammierung somatischer Zellen (Ribo-iPS)

Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz III. Medizinische Klinik und Poliklinik Experimentelle und Translationale Onkologie Obere Zahlbacher Str. 63 55131 Mainz

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Ugur Sahin 06131 17-9818 01GN1004 364.066 EUR 01.06.2010 - 31.05.2012

Die gezielte direkte Reprogrammierung humaner somatischer Zellen zu sogenannten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) mit definierten Transkriptionsfaktoren kann in Zukunft als Quelle von Stammzellen für die regenerative Medizin dienen. Ziel dieses Vorhabens ist es, iPS-Zellen zu generieren, indem die Transkriptionsfaktoren in Form von in vitro transkribierter Ribonukleinsäure (IVT RNA) transferiert werden (Ribotransfer). Im Gegensatz zu herkömmlichen Gentransfermethoden verändert der Ribotransfer das Genom der Zellen nicht, so dass die entstehenden iPS-Zellen (Ribo-iPS) für die regenerative Zelltherapie geeignet sind. Es ist vorgesehen, innerhalb der Förderperiode den technischen "Proof-of-Concept" zu führen. Anschließend soll die Ribo-iPS Technologie soweit optimiert werden, dass sie die Reprogrammierung durch stabilen Gentransfer hinsichtlich Sicherheit und Effizienz übertreffen kann. Die präferierte Transfermethode für IVT RNA in somatische Zellen ist die Elektroporation. Einer möglichen Limitierung der Methode bedingt durch den raschen Abbau der IVT RNA wird durch Einbau RNA-stabilisierender Sequenzen begegnet, wodurch die transiente Expression verlängert wird. Die Pluripotenz der generierten Ribo-iPS Zellen wird durch Erstellung von Genexpressionsprofilen und funktionelle Analysen in vitro und in vivo analysiert. Die Gewinnung humaner Ribo-iPS Zellen ist die zentrale Herausforderung und finaler Meilenstein dieses Vorhabens.

Isolation und Charakterisierung von Stammzellen aus dem adulten menschlichen Ovar

Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Medizinische Fakultät und Universitätsklinikum Heidelberg Institut für Anatomie und Zellbiologie Lehrstuhl III Neuroanatomie Im Neuenheimer Feld 307 69120 Heidelberg

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Thomas Skutella 06221 54-8228 01GN1001 397.123 EUR 01.08.2010 - 31.07.2013

Ziel des Vorhabens ist es, eine neue Quelle natürlich vorkommender menschlicher Stammzellen für eine autologe Zelltherapie für degenerative Erkrankungen bei Frauen zu erschließen. Es ist geplant, Stammzellen aus dem Oberflächenepithel des adulten menschlichen Ovars (OSE) mittels immunomagnetischer Methoden zu isolieren und eingehend zu charakterisieren. Eine stabile Linie von pluripotenten ovarialen Stammzellen soll unter konventionellen Kulturbedingungen etabliert werden. Um die Pluripotenz der ovarialen Stammzellen festzustellen, wird die Expression von Oberflächenantigenen und Transkriptionsfaktoren, wie sie charakteristisch für embryonale Stammzellen sind, analysiert und die Bildung von Teratomen in immundefiziente Mäuse nach Injektion der Stammzellen untersucht. In einer anschließenden Stufe wird versucht, die OSE-Stammzellen unter "feederfreien" Bedingungen und serumfreien Aufrechterhaltungsmedien zu kultivieren, wie es für embryonale Stammzellen des Menschen (hESCs) möglich ist. Das genetische Profil wird mit dem von männlichen adulten Keimbahnstammzellen (haGSCs), hESC-Zellen und primordialen Keimzellen, die aus spontanen Aborten generiert werden, verglichen. Diese Vergleiche können weitere Informationen über den Ursprung der Zellen liefern. Schließlich sollen die OSE-Stammzellen in verschiedene somatische Zellen differenziert werden.

Pluripotente parthenogenetische Stammzellen: Isolierung, Charakterisierung, genetische Manipulation und Bereitstellung für die kardiale Gewebezucht

Georg-August-Universität Göttingen Universitätsmedizin Göttingen Zentrum Pharmakologie und Toxikologie Abt. Pharmakologie Robert-Koch-Str. 40 37075 Göttingen

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Wolfram-Hubertus Zimmermann 055139-5781 01GN0827 176.991 EUR 01.03.2009 - 31.12.2012

Es sollen die Grundlagen für eine Anwendung parthenogenetischer Stammzellen (PSC) im Rahmen Zell- bzw. Gewebe-basierter kardialer Reparaturverfahren geschaffen werden. Das Vorhaben wird sich auf die Erforschung muriner parthenogenetischer Stammzellen fokussieren, um die Hypothese einer histokompatiblen Anwendung Herz-spezifischer PSC-Abkömmlinge zur Zell-basierten kardialen Reparatur zu überprüfen. Ziele sind: 1) Herstellung pluripotenter muriner PSCs; 2) Aufreinigung spezifischer kardialer Zelltypen wie z. B. Herzmuskelzellen, Endothelzellen und glatte Muskelzellen über Oberflächenmarker (Fluorescence-Activated-Cell-Sorting [FACS]) oder alternativ über genetische Selektionsverfahren; 3) Vergleich der Differenzierungskapazität von PSCs und embryonalen Stammzellen (ESCs); 4) Identifikation des tumorigenen Potenzials undifferenzierter PSCs sowie von deren differenzierten Derivaten; 5) Überprüfung der Histokompatibilität von PSCs bzw. PSC-Derivaten in vivo.

Isolierung und Charakterisierung von klonalen pluripotenten humanen adulten germalen Stammzelllinien

Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Zentrum für Regenerationsbiologie und Regenerative Medizin Paul-Ehrlich-Str. 15 72076 Tübingen

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Thomas Skutella 07071 29-72186 01GN0821 465.576 EUR 01.01.2009 - 31.12.2012

Das Projekt befasst sich mit der Optimierung des Anwendungspotenzials von humanen, adulten, pluripotenten, aus der Keimbahn abgeleiteten Stammzellen (human germline-derived stem cells = haGSCs). Diese Stammzelllinien stellen eine Alternative zur Nutzung von humanen embryonalen Stammzellen dar. Gegenüber humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS), deren Herstellung noch eine virale Transduktion erfordern, sind haGSCs frei von gentechnologischen Eingriffen. Basierend auf unseren bisherigen Arbeiten an haGSCs planen wir die folgenden Arbeiten durchzuführen: 1) die Generierung von klonalen haGSC-Linien unter Aufrechterhaltung der Pluripotenz, 2) die Charakterisierung dieser klonalen haGSC-Linien durch die Analyse ihrer Transkriptome, Epigenetik und Proteome. Diese Untersuchungen werden unsere Erkenntnisse über die Regulation der Pluripotenz von haGSCs auf dem molekularen und zellulären Niveau deutlich steigern. Darüber hinaus werden sie uns auch dem Ziel näher bringen, für die regenerative Medizin aus adulten Geweben klonale pluripotente Stammzelllinien zu generieren, die im Einklang mit den existierenden rechtlichen und ethischen Normen in Deutschland stehen.

Gewinnung vektorfreier-iPS Zelllinien

Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Institut für Entwicklungsgenetik (IDG) Ingolstädter Landstr. 1 85764 Oberschleißheim

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. Ralf Kühn 089 3187-2887 01GN0806 365.808 EUR 01.12.2008 - 31.10.2012

Die kürzlich gelungene Redifferenzierung (Reprogrammierung) von adulten Fibroblasten und anderen somatischen Zellen aus Mensch und Maus zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) besitzt großes Potenzial für die medizinische Forschung und regenerative Medizin. Zur Vermeidung der Nachteile der gegenwärtigen Reprogrammierungstechnik, dem Einsatz retroviraler Vektoren und geringer Effizienz, sollen in diesem Vorhaben Vektoren entwickelt werden, die es ermöglichen die Expression von Reprogrammierungsproteinen zu regulieren und den Vektor aus etablierten iPS-Zelllinien wieder zu entfernen. Zunächst soll die REPRO-Expressionkassette in den Rosa26 Locus von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) der Maus inseriert werden. Nach Injektion dieser ES-Zellen in Blastozysten und der Gewinnung embryonaler Fibroblasten kann die Funktionsfähigkeit der REPRO Expressionkassette überprüft werden indem die Anzahl gebildeter iPS-Zellkolonien bestimmt wird. Nach dieser ersten Evaluierungsphase soll aus diesen REPRO-ES-Zellen ein transgener Mausstamm erstellt werden. Dieser ermöglicht, optimale Parameter für die Reprogrammierung adulter somatischer Zellen zu bestimmen und den zellbiologischen Mechanismus der Reprogrammierung weiter zu untersuchen. Ist der Funktionsnachweis der REPRO-Expressionskassette erbracht, sollen zwei Verfahren entwickelt und verglichen werden bei denen die Vektoren in bestimmte genomische Loci integriert werden bzw. extrachromosomal verbleiben. Die Relevanz dieses Vorhabens für die regenerative Medizin liegt in der Entwicklung von Vektoren und Verfahren, die es in Zukunft ermöglichen aus Fibroblasten abgeleitete patientenspezifische, pluripotente Stammzelllinien zu etablieren, die weder virale Sequenzen noch aktive Expressionselemente mehr enthalten. Derartige Zellinien bzw. durch in vitro Differenzierung erhaltene Zelltypen werden für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen, die Wirkstoffentwicklung und toxikologische Studien von Nutzen sein.

 

b) Abgeschlossene Vorhaben