Cell-based regenerative medicine

 

Call for proposals:	2008
Funding period:	2009 - 2013
Funding volume:	18,5 mio EUR
Number of projects:	58

1. Objectives of funding

A lot of progress has been made in revealing the molecular mechanisms of the development of organs and tissues. Furthermore a population of hardly differentiated cells possessing a high proliferating capacity has been isolated and cultured. These cells are able to develop progenitors of a wide range of specialized cells and can build up different tissues. Naturally these precursor or stem cells are responsible for regeneration and repair processes following injuries and diseases and meanwhile have been identified in almost every tissue investigated.
On the basis of such knowledge systematic use of the body’s own regeneration potential in therapeutic approaches is becoming a distinct possibility. These new treatment strategies, covered by the term “regenerative medicine” may be applicable for any type of disease in which functions of single cell types, tissues or organs are affected.
Basic Research in this area has already been supported within the framework of the funding priority "Biological replacement of organ functions" of the Federal Government's Health Research Programme. However, considerable efforts are still needed for developing efficient methods and exploiting promising experimental approaches to clinical application.
The aim of the new measure is therefore to continue strengthening application-oriented research in the field of cell-based regenerative medicine as a follow-up to previous funding. Relevant research potential as well as the available know-how and resources are to be pooled by bringing together the best and most competent partners in interdisciplinary collaborations for the development of regenerative treatment concepts for defined clinical pictures.

2. State of the funding measure

At the beginning of 2008, the scientific community was invited to submit project applications by a public call. Until the deadline of application at 14 April 2008, 58 network proposals, comprising 232 subprojects, were submitted. In course of the project evaluation by an international review board, 15 networks comprising 57 subprojects, were selected for funding. The selected projects have started their work between March 2009 and March 2010.

3. Funded projects

a) Short description of current projects

(Sort according to project number)

Verbundprojekt: Multipotente mesenchymale Stromazellen (MSZ) zur Verbesserung des Langzeitüberlebens transplantierter Pankreas-Inselzellen

MSZ zur Induktion der Inselzelltoleranz im humanisierten Diabetes Modell

Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Medizinische Fakultät und Universitätsklinikum Zentrum für Kinderheilkunde Abteilung für Pädiatrische Hämatologie und Onkologie Adenauerallee 119 53113 Bonn

Leiterin: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Dagmar Dilloo 0228 287-33215 01GN0990 367.164 EUR 01.10.2009 - 30.09.2012

Neben ihrem Differenzierungspotenzial besitzen humane mesenchymale Stromazellen (MSZ) die Fähigkeit Proliferation und Effektorfunktionen verschiedener Immunzellen zu inhibieren. Als Zelltherapeutika sind MSZ so vielversprechende Kandidaten, um die Geweberegeneration und die Allotoleranz im Rahmen der Gewebeersatztherapie für inflammatorische Erkrankungen wie der pankreatischen Inselzelltransplantation beim Diabetes Typ-1 zu optimieren. Daher ist die systemische MSZ-Applikation zur Modulation der allogenen Immunantwort gegen Inselzelltransplantate in einem murinen Xeno-Transplanationsmodell vorgesehen. Dieses chimäre Modell des Diabetes Typ-1, in welchem sich nach Transplantation aufgereinigter CD34+ Vorläuferzellen ein funktionales humanes lymphohämatopoetisches System etablieren lässt, ermöglicht es nach Xenotransplantation humaner Pankreasinseln und humaner MSZ, die komplexen zellulären Interaktionen in Vorbereitung auf spätere klinische Studien zu untersuchen. In diesem Modell wird der Effekt der systemischen MSZ-Administration auf das Überleben allogener Inselzelltransplantate sowie die Korrektur des diabetischen Phänotyps evaluiert. Dabei sind die molekularen Mediatoren der MSZ-vermittelten Immunsuppression wie die Indoleamin 2, 3 Dioxygenase (IDO) und das Prostaglandin E2 (PGE2) von besonderem Interesse, deren Rolle in der MSZ-abhängigen Inselzellprotektion mit Hilfe chemischer Inhibitoren sowie der siRNA "knock-out" Technologie charakterisiert wird.

 

Cell Therapeutic Approaches in Models of Biliary Fibrosis

Liver damage and chronic liver diseases represent a significant and severe health care problem with high medical needs since there are no efficient therapies so far. Currently, the only treatment option for the end-stage disease is liver transplantation, which is associated with severe medical complications and hampered by the scarcity of organ transplants. Preventing the progression of fibrogenesis and the revival of endogenous repair mechanisms would be beneficial for patients and reduce long-term treatment costs. Therefore, the aim of the consortium is to establish the foundations for alternative cell-based therapy approaches to human liver disease. Within the consortium, different cell sources - small hepatocytes, programmable cells of monocytic origin (PCMOs), embryonic stem cells and hepatocyte-like cells (NeoHeps) - are profoundly characterized, scaled up to an amount sufficient for transplantation and tested for their suitability to treat biliary fibrosis in animal models of liver disease.

Identification and characterization of transplanted cells in liver tissue (Subproject 2)

Leibniz-Institut für Arbeitsforschung an der Technischen Universität Dortmund Ardeystr. 67 44139 Dortmund

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Jan Hengstler +49 231 1084-348 01GN0988 236.470 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

Identification of transplanted cells and their characterization are important milestones in the part of the consortium’s work plan that will be covered by this subproject. We recently have established techniques that allow identification of transplanted cells in mouse livers based on in situ hybridization and characterization of their integration into the liver microarchitecture (Brulport el al., Hepatology. 2007;46(3):861-70). This technique is based on reconstruction of liver tissue from confocal laser scans and will be applied to identify the transplanted cells. In a next step the identified cells will be characterized by immunostaining for hepatocellular factors, including CYP1A, CYP3A and albumin. If these results are positive, cells will be isolated for functional characterization. By a cooperating project (ESNATS, an EU funded network focussing on generation of differentiated cells from hESC and mESC for use in toxicity testing) hepatocyte-like cells are available that in the present project will be compared to primary hepatocytes (including the small hepatocyte subpopulation of subproject 1) and with monocyte derived cells (of subprojects 3 and 5) for their capacity to improve liver function in mouse models of hepatic fibrosis.

Evaluation of liver fibrosis scores in mice after cell transplantation based therapy (Subproject 5)

Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Medizinische Fakultät und Universitätsklinikum Mannheim II. Medizinische Klinik Molekulare Gastroenterologie Theodor-Kutzer-Ufer 1-3 68167 Mannheim

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Steven Dooley +49 621 383-3768 01GN0987 225.252 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

End stage liver disease, by e.g. chronic intoxication with ethanol or HBV/HCV infection, is one of the leading causes of death worldwide. Currently, liver transplantation is the only available treatment option for liver failure. Thus, donor organ scarcity raises a strong demand in new therapeutic options. We and others have delineated molecular mechanisms of chronic liver disease progression and demonstrated that TGF-beta mediated activation of hepatic stellate cells (HSCs) is a major step in fibrogenesis. Most of the work has been done in vitro, with primary cultured HSCs or hepatocytes, isolated from human patients, rats or mice. Additionally, animal models for chronic liver disease have been established, e.g. CCI4 treatment and bile duct ligation, and the impact of anti TGF-beta treatment on fibrogenesis has been evaluated in vivo. The same mouse models and in addition Mdr2-/-, which spontaneously develop liver damage progressing to cirrhosis and hepatocellular carcinoma, are used in this subproject. While establishing an initial approach to transplant mouse hepatocytes in these animal models, alternative cell types (undifferentiated and differentiated SHs, PCMOs and NeoHeps) are optimized and characterized for further transplantations. Following transplantation, the impact of the various cell types on chronic liver failure is investigated by measuring liver damage and fibrosis scores. The aim of the project is to provide in vitro generated hepatocytes for future toxicity testing and patient treatment.

Hepatic repair from fibrosis by cell-based therapy and local EPO preconditioning (Subproject 4)

Universität Rostock - Medizinische Fakultät Institut für Experimentelle Chirurgie Schillingallee 69a 18057 Rostock

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Brigitte Vollmar +49 381494-6220 01GN0986 297.251 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

Beside liver transplantation as ultimate treatment option in end-stage liver disease, an alternative less invasive approach may be transplantation of progenitor cells both to halt progression and/or to revive endogenous repair mechanisms. Supportive strategies enhancing the homing tendency and the successful engraftment of exogenously applied progenitor cells should target the local microenvironment and could comprise preconditioning manoeuvres of the liver. Thus, livers of chronic bile duct ligated mice and of Mdr2-/- mice, which spontaneously develop hepatic fibrosis, will be conditioned by erythropoietin prior to the transplantation of SH cells (subproject 1), PCMOs (subprojects 3 and 5) and ES cells (subproject 2) each of male sex. Usage of female mice expressing enhanced green fluorescent protein and Y-chromosome in all hematopoietic-derived cells will further allow discriminating engraftment of transplanted cells from hematopoietic cells. We will (i) track the intrahepatic cell homing and engraftment by in vivo imaging, (ii) assess the hepatic homeostasis by albumin and urea synthesis, plasma ammonia, bilirubin and transaminase levels, and (iii) establish the regenerative repair by quantification of hepatic mRNA transcripts of alpha-SMA, PDGF receptor-ß, collagen-1alpha and TIMPs (ARG-Ma). Preconditioning regimen to enhance the engraftment of progenitor cells and the reversal of fibrosis might open the possibility to effectively treat chronic liver disease by cell-based therapy.

Improvement of PCMO expansion in vitro by blocking TGF-beta/activin signalling (Subproject 3)

Christian-Albrechts-Universität zu Kiel Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Klinik für Allgemeine Chirurgie und Thoraxchirurgie Arnold-Heller-Str. 7 24105 Kiel

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Hendrik Ungefroren +49 431 597-2039 01GN0985 251.292 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

We have previously established culture conditions for the conversion of human peripheral blood monocytes into Programmable Cells of Monocytic Origin (PCMOs). PCMOs are considered multipotent, since they can subsequently adopt the phenotype of other specialized cell types, such as hepatocyte-like cells (NeoHeps). Although PCMOs transiently proliferate, the overall number of cells obtainable during in vitro culture would still be insufficient for clinical transplantation to cure liver disease. Prompted by the discovery that treatment of PCMOs with the TGF-ß/activin receptor inhibitor SB431542 strongly increased their proliferation, hinting to a growth-inhibitory autocrine loop, we plan to identify the underlying mechanism, including identification of the receptor-ligand interactions involved. Given the known role of TGF-ß/activin signalling in the control of cellular pluripotency, possible adverse effects of SB431542 (or more specific inhibition of its targets once identified) on PCMO multipotency are assessed. This is done in close collaboration with the consortium partners by analysing i) the in vitro differentiation potential towards NeoHeps of standard PCMOs and PCMOs with enhanced proliferation potential, and ii) the ability of these cells to improve liver function following transplantation into two mouse models of hepatic fibrosis.

Small hepatocytes in liver regeneration (Subproject 1)

Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie Ismaningerstr. 22 81675 München

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Andreas Nüssler +49 89 4140-6310 01GN0984 297.826 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

Hepatic dysfunction in human beings is caused by various diseases such as hepatitis, hepatic cirrhosis and liver tumours. Currently, orthotopic liver transplantation is the preferred method to overcome liver dysfunction. Another less invasive possibility is the use of cell transplantation. However, one limitation of cell-based therapies is either availability or quantity of primary human hepatocytes. There are no known options to stimulate the proliferation of functional human hepatocytes with any of the cytokines known to promote liver regeneration. One feasible source to overcome this limitation are precursor cells. Small hepatocytes (SHs), a subpopulation of hepatocytes, have high growth potential in culture. Although the cells are less than half the size of mature hepatocytes, they possess hepatic characteristics such as albumin secretion, Connexin32 and alpha-Fetoprotein expression. In preliminary experiments we were able to isolate rodent and human SHs. Thus, the aim of this subproject is the isolation, propagation, differentiation and characterization of rodent and human SHs. Then, cells will be tested to correct two models of liver fibrosis in collaboration with others partners of the consortium.

Verbundprojekt: Multimodaler Ansatz für eine regenerative Schlaganfalltherapie (MARS)

In diesem Verbund soll ein neuartiger synergistischer, auf gezielter Zell- und Wirkstoffapplikation beruhender Therapieansatz für den ischämischen Schlaganfall entwickelt und auf seine Wirksamkeit hin getestet werden. In einem weiteren, zellbasierten Ansatz soll mit einer neuen Zellsubpopulation aus dem adulten Knochenmark (SD-BMSC) ein regeneratives Therapiekonzept auf der Basis von Neuroprotektion und restaurativem Gewebeersatz entworfen werden. Damit werden wesentliche Anforderungen an eine neue Therapie für den ischämischen Schlaganfall umfassend und präzise beantwortet werden können. In diesem Verbund erfolgt auf der Basis grundlagenwissenschaftlicher Erkenntniss die Translation in anwendungsorientierte Forschung zur Entwicklung klinisch relevanter Therapiestrategien für den ischämischen Schlaganfall, die auf die Konzeption einer klinischen Studie im Anschluss an das Vorhaben zielen.

Therapeutischer Nutzen der Verabreichung von Knochenmarkstammzellen nach einem Schlaganfall bei alten Ratten (TP 5)

Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald Universitätsklinikum - Klinik und Poliklinik für Neurologie Molekulare Neurobiologie Ellernholzstr. 1-2 17489 Greifswald

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Aurel Popa-Wagner 03834 86-6853 01GN0982 291.570 EUR 01.05.2009 - 30.04.2012

Ziel ist die Entwicklung neuer Strategien zur Reparatur des Gehirns und zur Wiederherstellung der Funktionalität in gealterten Ratten durch die Behandlung mit G-CSF und die Transplantation von Knochenmarkstammzellen. Die genauen Zielsetzungen dabei sind: 1) Untersuchung der Auswirkungen der Kombination von Zelltherapie mit BM MNC (Projekt V) oder prädifferenzierten mesenchymalen Zellen (Projekt VI) und G-CSF-Behandlung auf die langfristige funktionelle Erholung nach einem Schlaganfall in gealterten Ratten; 2) Erforschung der grundlegenden Mechanismen dieser Behandlung inklusive der Neurogenese und Angiogenese und deren Auswirkungen auf die funktionelle Erholung nach einem Schlaganfall in gealterten Ratten; 3) Entwicklung eines präklinischen Protokolls für die Anwendung einer G-CSF- bzw. Knochenmarkstammzell-Therapie nach einem Schlaganfall in gealterten Ratten. Es wird erwartet, dass eine kombinierte Therapie bestehend aus G-CSF und BM MNC-Anwendung, die Erholung der Funktionalität und des Hirngewebes nach einem Schlaganfall in gealterten Ratten verbessert. Außerdem wird ein präklinisches Protokoll für die Anwendung der Zelltherapie für die Neurorestoration nach einem Schlaganfal entwickelt.

Therapeutisches Zeitfenster einer kombinierten Therapie mit G-CSF und BM-MNC; Neuroprotektive und neurorestaurative Wirkung von SD-BMSC (TP 4 und 6)

Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie (IZI) Perlickstr. 1 04103 Leipzig

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. Johannes Boltze 034 1972-5814 01GN0981 454.812 EUR 01.05.2009 - 30.04.2012

Es werden zwei unterschiedliche therapeutische Ansätze hinsichtlich ihrer Wirksamkeit auf den Heilungsverlauf nach Schlaganfall untersucht. Im ersten Ansatz wird das therapeutische Zeitfenster einer kombinierten Therapie mit G-CSF und BM-MNC evaluiert. In einem zweiten Ansatz wird eine neue pluripotente Stammzellpopulation aus dem Knochenmark (SD-BMSC) in einem erweiterten experimentellen Szenario auf neuroprotektive und neurorestaurative Wirkungen untersucht. Beide experimentelle Ansätze werden in einem etablierten Schlaganfallmodell in der Ratte untersucht. Surrogatparamter für die Einschätzung der therapeutischen Wirksamkeit werden über funktionelle Tests, MRT-Untersuchungen und Histologie bestimmt. Im Kombinationsansatz G-CSF/BM-MNC wird das optimale therapeutische Zeitfenster evaluiert, während im zweiten Ansatz neben der prinzipiellen Wirksamkeit auch die Wirkungsmechanismen einer SD-BMSC Transplantation eruiert werden. Die bei der Planung der Experimente berücksichtigten Qualitätskriterien erlauben im Falle positiver Ergebnisse eine schnelle und sichere Translation in eine klinische Studie der Phase IIa.

Verbundprojekt: Integration von aus Stammzellen gebildeten Neuronen

Es gibt einen großen Bedarf für die Entwicklung neuer Therapiekonzepte für neurologische Erkrankungen. Stammzellbasierte Zellersatztherapie für das ZNS hat den funktionellen Ersatz für zugrunde gegangene Nervenzellen zum Ziel. Eine bisher ungelöste Herausforderung ist die funktionelle Integration von aus Stammzellen gebildeten Neuronen in die bestehenden neuralen Netzwerke.
Dieser Verbund kombiniert die Expertise in den Bereichen neurale Stammzellbiologie und adulte Neurogenese, Elektrophysiologie, Genomik, Molekularbiologie, virale Vektor-Technologie und der Generierung von Tiermodelle für neurologische Erkrankungen um a) die Mechanismen, die der Integration von neugeborenen Neuronen im gesunden adulten Gehirn zugrunde liegen, zu charakterisieren; b) eine vergleichende Analyse der Integration von neugeborenen Neuronen im physiologischen Kontext und im Krankheitskontext durchzuführen; c) zu testen, inwieweit physiologische Mechanismen, die Integration von neugeborenen Neuronen im Krankheitskontext fördern.

Integration in das Striatum (TP 5)

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Universitätsklinikum - Neurologische Klinik Schwabachanlage 6 91054 Erlangen

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Jürgen Winkler 09131 85-39323 01GN0979 226.788 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

Die zellbasierte Therapie beim Morbus Parkinson (IPS) aus endogenen, der Subventrikulärzone (SVZ) entstammenden Nervenzellen zielt darauf, Zellen in das läsionierte Striatum zu dirigieren, funktionell zu dopaminergen Neuonen zu differenzieren und in lokale Schaltkreise zu integrieren. Ziel ist das Differenzierungsvermögen von unreifen Nervenzellen im 6-OHDA Modell nach EGF/ FGF-2 Infusion zu explorieren, das Expressionsprofil von unreifen Zellen im Striatum mit neuralen SVZ-Populationen zu vergleichen und genetisch sowie pharmakologisch Zelldifferenzierung, Überleben und Integration in das Striatum zu fördern. Folgende Arbeitsplanung ist vorgesehen: 2009: In vivo-Zeitreihenanalyse nach retroviraler Injektion und EGF/ FGF-2 Infusion, Untersuchung des CREB-Signalweges sowie der Transkriptionsfaktoren c-fos/ Zif-268, elektrophysiologische Charakterisierung der markierten Zellen; 2010: Expressionsanalyse von unreifen Neuronen in neurogenen vs. nicht neurogenen Regionen mittels quantitativer RT-PCR (CREB-, TGF-ß-Signalweg, Rezeptoranalyse für BDNF sowie der Neurotransmitter GABA/NMDA); 2011: Induktion der dopaminergen Differenzierung durch Wnt1 und lmx1a; Aktivierung des CREB-Signalweges durch Rolipram; 2012: Funktionelle Charakterisierung mit Zelldifferenzierung, Überleben, Integration und Verhaltenstestung. Die Ergebnisse werden wichtige Informationen hinsichtlich des Überlebens, Differenzierungspotenzials und der Integration von neuralen Stammzellen aus der SVZ zur zellulären Therapie beim Morbus Parkinson erbringen. Erwartet wird, dass durch die Aktivierung unterschiedlicher Signalwege eine dopaminerge Differenzierung zur funktionellen Wiederherstellung des nigrostriatalen Systems beiträgt.

Wirkung von TGF-beta auf neuronale Integration (TP 6)

Universität Regensburg Universitätsklinikum Klinik und Poliklinik für Neurologie Franz-Josef-Strauss-Allee 11 93053 Regensburg

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. Sebastien Couillard-Despres 0941 944-8950 01GN0978 261.655 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

Das Vorhaben untersucht die Rolle von TGF-beta bei der Produktion und Integration neuer Neurone im Schlaganfall-Tiermodell. Hierbei werden TGF-beta-Signalkaskadekomponenten in zur Läsion rekrutierten unreifen Neuronen charakterisiert. Außerdem wird durch konditionale Deletion des TGF-beta-Rezeptors in neuralen Stammzellen und/oder in neuen Neuronen abgeklärt, inwieweit zell-intrinsiche und zell-extrinsische TGF-beta-Aktivitäten auf Integration und Überleben in Läsionsnähe wirken. Durch TGF-beta-Gabe wird versucht, die Integration der rekrutierten neuen Neurone zu fördern. Neue Neurone werden durch Genexpressionsprofilierung charakterisiert. Es werden in vivo-Biolumineszenz-Bildgebungsverfahren eingesetzt, um die Integration neuer Neurone zu analysieren.

Integration neu entstandener unreifer Neurone in der Umgebung kortikaler Läsionen (TP 4)

Universitätsklinikum Jena Klinik für Neurologie Erlanger Allee 101 07747 Jena

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Christoph Redecker 03641 93-23433 01GN0977 230.021 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

Ziel ist die funktionelle Bedeutung und Integration von unreifen Neuronen in der Umgebung kortikaler Hirnläsionen zu analysieren. Nach fokalen Läsionen im erwachsenen Kortex wandert eine erhebliche Population von proliferierenden Zellen, die typische Marker unreifer Neurone exprimieren, in die Läsionsumgebung ein. Die meisten dieser Neuroblasten gehen im Verlauf der ersten Wochen wieder unter, doch lässt sich durch Gabe des Wachstumsfaktors BDNF (brain-derived neurotrophic factor) ihre Zahl verdoppeln und die Bildung weniger reifer Neurone auslösen. Durch die Kombination elektrophysiologischer, morphologischer und molekulargenetischer Methoden soll die funktionelle Rolle und Integration dieser unreifen Neuroblasten aufgeklärt und insbesondere untersucht werden, inwieweit aktivitätsabhängige Prozesse bei diesen Prozessen beteiligt sind. In weiteren Untersuchungen soll dann analysiert werden, welchen Einfluss der Neurotransmitterphänotyp exogener, in die Infarktumgebung transplantierter neuraler Stammzellen aus der Subependymalzone die Integration im läsionierten Kortex beeinflusst. Durch ein besseres Verständnis der Mechanismen, die die Integration von neuen Nervenzellen im bestehenden kortikalen Netzwerk hemmen bzw. fördern, sollen neue Ansatzpunkte für regenerative, stammzellbasierte Therapiestrategien identifiziert werden.

Pseudotypisierte Tollwutviren zur Markierung von Synapsen zu neu integrierten Neuronen (TP 3)

Ludwig-Maximilians-Universität München Institut für Physiologie Lehrstuhl für physiologische Genomik Schillerstr. 46 80336 München

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. Benedikt Berninger 089 2180-75208 01GN0976 236.292 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

Eine Zellersatztherapie bei neurodegenerativen Erkrankungen zielt auf eine funktionelle Wiederherstellung der geschädigten neuronalen Schaltkreise durch das Hinzufügen neuer Neurone ab. In diesem Vorhaben wird ein Verfahren entwickelt, welches erlaubt, die Integration neuer Neurone direkt sichtbar zu machen. Die Methode basiert auf der Anwendung pseudotypisierter Tollwutviren zur Markierung monosynaptischer Verbindungen zwischen bereits existierenden und neu integrierten Neuronen. Modifikationen des Virusgenoms sollen es ermöglichen, die markierten Neurone durch Licht zu aktivieren (durch die virusvermittelte Expression von Channelrhodopsin) bzw. in diesen Kalziumsignale (durch virusvermittelte Expression genetischer Ca2+-Indikatoren) nachzuweisen. Dabei sollen diese neuen Methoden bei der Untersuchung der physiologischen Integration neuer Neurone im erwachsenen Hippocampus sowie transplantierter neuronaler Vorläuferzellen in einem photothrombotischen neokortikalen Läsionsmodell zur Anwendung kommen. Folgende Arbeitsplanung ist vorgesehen: 2009: Klonierung von Channelrhodpsin-2 (ChR-2) und TN-XXL kodierender Tollwutviren und deren Validierung in Zellkultur. Start der in vivo-Studien. 2010: In vivo-Injektion der Retro- und Tollwutviren in den Gyrus dentatus von adulten Mäusen, zur Komplementation des defekten Tollwutvirusgenoms durch retroviral kodiertes Glykoprotein als Voraussetzung des transsynaptischen Transport. Validierung durch patch clamp Analyse im Hirnschnitt. 2011: In vivo-Injektion der ChR-2 und TN-XXL kodierenden Tollwutviren und bildgebende Analyse. 2012: Abschließende Analyse. Es wird erwartet, dass die Ergebnisse dieser Studie wertvolle Informationen für die anderen Teilprojekte hinsichtlich der funktionellen Integration unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen liefern.

Systemgenetik des Überlebens neuer Nervenzellen (TP 2)

Forschungszentrum für Regenerative Therapien Dresden (CRTD) der Technischen Universität Dresden Biotechnologisches Zentrum Tatzberg 47-49 01307 Dresden

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Gerd Kempermann 0351 463-40086 01GN0975 218.694 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

Neuronale Aktivität sowie auch Verhaltenaktivität fördert das Überleben neuer Nervenzellen im erwachsenen Hippocampus. Das Ziel des Vorhabens ist es, einen Beitrag zur Beschreibung der komplexe Genetik dieses überlebensfördernden Effekts zu leisten. Das Projekt besteht aus drei Experimenten: 1) Identifizierung von invarianten Überlebensgenen in den verschiedenen experimentellen Paradigmen des Vebundes; 2) Vergleich des Überlebens intrinsischer, neugebildeter Nervenzellen mit transplantierten Zellen und 3) Untersuchung des Kandidatenmoleküls p27Kip1. Die verwendeten Methoden sind: Verhaltenstests und Trainingsparadigmen, Immunhistochemie und Stereologie, FACS, Vorläuferzellkulturen und mathematische Modellierung.

Charakterisierung des Aktivitäts-anhängigen CREB Signalwegs bei der Integration von neugebildeten hippokampalen Neuronen (TP 1)

Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Institut für Entwicklungsgenetik (IDG) Ingolstädter Landstr. 1 85764 Oberschleißheim

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. Dieter Chichung Lie 089 3187-2927 01GN0974 391.647 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

Neuronale Aktivität spielt für das Überleben und die Integration von neugeborenen Nervenzellen eine entscheidende Rolle. Ziel des Projekts ist die Charakterisierung der Signalwege, die durch neuronale Aktivität aktiviert werden, um die Mechanismen für das Überleben und die Integration von neugeborenen Neuronen zu entschlüsseln. Mittels gain- and loss-of-function Experimenten mit Retroviren, elektrophysiologischer Analyse und Transskriptomanalyse wird der Effekt einer gesteigerten Aktivität des CREB-Signalwegs auf die Reifung, das Überleben und die Integration von neuentstandenen Neuronen charakterisiert. Es wird die Morphologie der Dendriten und die Expression neuronaler Marker nach Aktivierung des CREB-Signalwegs im Vergleich zu Kontrollgruppe evaluiert. Mittels PatchClamp-Untersuchungen werden Effekte eines verstärkten CREB-Signals auf die Morphologie mit den elektrophysiologischen Eigenschaften korreliert und die Faktoren upstream des CREB-Signalweges in neugeborenen unreifen Neuronen charakterisiert. Neugeborene unreife Neurone erhalten zu verschiedenen Zeitpunkten GABAergen und NMDA-Rezeptor vermittelten exzitatorischen Input. Mittels retroviral-vermitteltem Gentransfer wird dieser Input spezifisch in unreifen Neuronen des Gyrus dentatus manipuliert und in der Folge die Aktivität des CREB-Signalweges untersucht. Desweiteren werden die Ziele downstream des CREB Signals identifiziert, die die Reifung, das Überleben und die Integration von neugeborenen Neuronen regulieren. Es werden Transskriptomanalysen durchgeführt um die Kandidaten-Ziele des CREB-Signals zu identifizieren. Nachweislich hoch oder nach unten regulierte Gene werden auf ihre Rolle in CREB vermittelten Prozessen in neugeborenen Neuronen untersucht. Es wird erwartet, dass die Ergebnisse aus diesem Projekt zu Hypothesen darüber führen, welche Signalwege die Integration von aus Stammzellen gewonnenen Neuronen im Kontext von Krankheiten steuern und fördern.

Verbundprojekt: Stammzelltherapie für schwere hereditäre Hautfragilitätssyndrome

Ziel ist es, experimentell Behandlungsoptionen für schwere Hautfragilitäts-Syndrome zu entwickeln. Das Behandlungskonzept basiert auf der systemischen Stamm-Zell-Therapie (SCT). Das Konsortium verbindet Partner mit ausgesprochen hoher Expertise in Diagnose und Behandlung schwerer Hautfragilitäts-Syndrome mit Partnern, die hohe Expertise im Bereich der entsprechenden Modellkrankheiten der Maus besitzen. Die ausgewiesenen Expertisen liegen in den Bereichen Pathophysiologie, molekulare Genetik, Haut- und Basalmembran-Biologie, Immunologie, Hämatoonkologie und SCT. Dies erlaubt Kausaltherapien für mutierend und teils auch tödlich verlaufende, schwere Hautfragilitäts-Syndrome zu entwickeln, wie die Epidermolysis bullosa (EB).

Immunüberwachung von genetisch bedingten Hautfragilitätssyndromen nach Stammzelltherapie (TP 5)

Philipps-Universität Marburg FB 20 Medizin und Universitätsklinikum Zentrum für Hautkrankheiten Deutschhausstr. 9 35037 Marburg

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Michael Hertl 06421 58-66280 01GN0973 237.430 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

Der therapeutische Ansatz der Knochenmarks- bzw. Stammzelltransplantation bei genetischen Hautfragilitätssyndromen erscheint sehr vielversprechend, um fundamentale Fragen zur Entstehung von Autoimmunität  zu verstehen. Ziel dieses Projektes ist es, zu sehen, ob die therapeutische Expression eines Neo-Antigens durch Knochenmark- bzw. Stammzelltransplantation zu einer Autoimmunerkrankung führt. Die Anwendung der Knochenmark- bzw. Stammzelltherapie bei zwei verschiedenen in vivo-Modellen genetischer Fragilitätssyndrome (Dsg3.KO) Maus und Kollagen VII-hypomorphe Maus bietet die einmalige Gelegenheit, die Entwicklung organisch-spezifischer Autoimmunität der Haut- und Schleimhäute zu untersuchen. In diesem Teilprojekt werden zelluläre als auch humorale Immunmechanismen gegenüber den durch die Transplantation neu vorliegenden Autoantigenen Dsg3 und Kollagen VII verfolgt. Schwerpunkt ist die essentielle Interaktion autoreaktiver CD4-positiver T-Zellen und B-Zellen, deren Erfassung die Erkennung von Autoimmunreaktionen bereits im vorklinischen Stadium ermöglicht.

Kontrolle der Qualität der Basalmembran (TP 4)

Universität zu Köln Medizinische Fakultät – Universitätsklinikum Klinik und Poliklinik für Dermatologie und Venerologie Kerpener Str. 62 50937 Köln

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Dr. Thomas Krieg 0221 478-4500 01GN0972 222.725 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

In der Haut ist die Basalmembran eine hoch spezialisierte Extrazelluläre Matrix, die Epidermis und Dermis miteinander verbindet. Die struktuelle und funktionelle Integrität dieser Struktur ist absolut notwendig für eine physiologische Verankerung der basalen Keratinozyten. Einige Komponenten sind besonders kritisch wie z. B. Kollagen VII und XVII, Laminin 332, Integrinen a6b4. Diese bilden eine funktionelle Einheit, die sogenannte Keratinozyten Adhäsionsmaschine (KAM), welche verantwortlich für die Verankerung von Keratinozyten ist. Das Fehlen oder eine Veränderung einer der Komponenten der KAM resultieren in der Bildung von Blasen an der Haut bei Patienten. Es ist das Ziel die Fehlfunktionen von KAM zu korrigieren, indem man versucht die Integrität des KAM-Komplexes wiederherzustellen. Es soll festgestellt werden, ob und zu welchem Ausmaß die molekulare und funktionelle Integrität von KAM in den Mausmodellen des Konsortiums wiederhergestellt werden kann. Dieses wird mit Hilfe der immunologischen, biochemischen und funktionellen  Analysen in der Haut und in kultivierten Zellen erreicht.

Stammzelltherapie bei schwerer dystropher Epidermolysis bullosa (DEB) (TP 3)

Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Universitätsklinikum - Hautklinik Hauptstr. 7 79104 Freiburg

Leiterin: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Leena Bruckner-Tuderman 0761 270-6716 01GN0971 267.431 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

Dieses Vorhaben wird Knochenmarkstransplantation (KMT) bzw. Stammzelltherapie (SZT) als neue systemische Therapie für die dystrophe Epidermolysis bullosa (DEB) etablieren, unter Verwendung des Kollagen VII hypomorphen Mausmodells (KolVII Hypo). DEB wird auf molekularer Ebene durch Mutationen im COL7A1-Gen, welches für Kollagen VII - Hauptbestandteil der Verankerungsfibrillen - kodiert, verursacht. Es wurde  eine KolVII Hypo Maus generiert, welche aufgrund von auf 10% verringertem Kollagen VII DEB entwickelt. Die Maus ist immunkompetent und lebt bis ins Erwachsenenalter. Sie zeigt alle Symptome der humanen DEB und ist deshalb ideal für die Testung von Therapieansätzen geeignet. Zusammen mit den Partnern dieses Konsortiums wird KMT/SZT als eine systemische Therapie für DEB in der KolVII Hypo Maus etabliert, molekulare Mechanismen und therapeutische Effekte, sowie - falls vorhanden - Nebenwirkungen untersucht. Dies dient als grundlegende Vorbereitungen für die zukünftige Therapie von DEB-Patienten.

Hämatopoetische Stammzellen als Therapie bei hereditären Epidermolysen; Mesenchymale Stammzellen als Therapie bei hereditären Epidermolysen (TP 1 und 2)

Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum und Medizinische Fakultät - Hautklinik Liebermeisterstr. 25 72076 Tübingen

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Martin Röcken 07071 29 84574 01GN0970 441.579 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

Teilprojekt 1: Desg3.KO Mäuse können keine Desmosomen und somit keine festen Verbindungen zwischen Keratinozyten etablieren. Deswegen entwickeln Dsg3.KO Mäuse eine schwere blasenbildende Erkrankung der Haut mit Erosionen und Kachexie. Es wurde festgestellt, dass eine Stamm-Zell-Therapie (SCT) mit CD45+kit+ Knochenmarkzellen von Desg3-exprimierenden Donoren die Haut der Desg3.KO Mäuse mit Desg3-exprimierenden Keratinozyten wiederherstellen kann. Dabei erholten sich die Mäuse auch wieder von ihrer Kachexie. Da Keratinozyten mit Donor-stämmigen Marken auch in der Haut von Menschen nach SCT auftreten, wird die Möglichkeit erforscht, schwere Haut-Fragilitäts-Syndrome mit SCT zu behandeln. Mit Hilfe EGFP-exprimierender Stammzellen (SC), wird analysiert, welche SC (hämatopoetische, mesenchymale, spezialisierte Keratinozyten) die Fähigkeit besitzen, die Haut von Desg3.KO Mäusen wiederherzustellen. Es wird die Migration und Vereitlung der EGFP-exprimierenden Zellen in verschiedenen Organen und der Haut bestimmt, der Ort der SC-Immigration in die Haut, der Haarbulbus oder die dermalen Reteleisten, und die Differenzierung und Migration der SC innerhalb der Epidermis. Da Desg3.KO Keratinozyten ein spezifisches ‘knock out’ Konstrukt besitzen, kann bestimmt werden, ob die Keratinozytenrekonstitution mit EGFP+Desg3+ Zellen nach der SCT auf Zellfusion mit oder auf Transdifferenzierung von SC beruht. Weiter wird die Rekrutierung von Patienten mit schweren Haut-Fragilitäts-Syndromen gemeinsam mit Partner 03, 04 und 05 organisiert, um die Basis für die SCT bei Menschen in drei Jahren vorzubereiten. Teilprojekt 2: Epidermolysis bullosa ist entweder eine letale oder verstümmelnde angeborene Stoffwechselerkankung, deren Management schwierig ist in Bezug auf die therapeutischen Optionen. Knochenmarktransplantation (KMT) stellt die Plattform dar, um neuartige zelluläre Therapien zu entwickeln, die auf Gewebereparatur über das hämatopoetischen System hinaus abzielen. In diesem Teilprojekt soll das klinische Potenzial von MSC in vitro und in vivo anhand eines Mausmodells der Epidermolysis bullosa (EB) untersucht werden. Insbesondere das Migrationsverhalten, die Interaktionen mit ausdifferenzierten Geweben und Transdifferenzierung versus parakrine Effekte von MSC sollen analysiert werden. Besonderes Augenmerk wird auf die Herstellung von MSC gelegt werden, die entweder direkt durch Antikörper aus dem Knochenmark isoliert oder nach GMP-konformen Kulturbedingungen expandiert werden. Zusammengefasst wird dieses Teilprojekt präklinische Daten zusammentragen, um eine Co-Transplantationsstrategie von HSC und MSC mit hoher Patientensicherheit in die Klinik transferieren zu können.

Verbundprojekt: Stammzelltherapie der Hirschsprung-Erkrankung

Neurale Stamm- und Vorläuferzellen des enterischen Nervensystems (ENS) werden mittlerweile als eine mögliche Zellquelle angesehen, um zukünftig neurogastrointestinale Erkrankungen wie z. B. den Morbus Hirschsprung zelltherapeutisch behandeln zu können. Die Hirschsprung-Erkrankung ist die häufigste enterische Neuropathie mit einer Inzidenz von 1:5.000 und ist oft mit weiteren entwicklungsabhängigen Anomalien assoziiert. Bei dieser
Erkrankung führt das Fehlen oder die Verminderung der enterischen Ganglienzellen im aboralen Kolon zu einer Engstellung des betroffenen Darmsegments und damit zu einer Missregulation der Darmmotilität. In jüngerer Zeit konnte die erfolgreiche Isolation, Expansion und Differenzierung von humanen enterischen neuralen Stamm- und Vorläuferzellen, die aus neonatalem und adultem Darm gewonnen wurden, gezeigt werden. In diesem Verbundprojekt soll das therapeutische Potenzial dieser Stamm- und Vorläuferzellen aus gesunden und pathologisch veränderten intestinalen Geweben detailliert untersucht werden. Dazu soll in Kooperation mit universitären und industriellen Partnern die Stammzellkapazität und das Integrationspotenzial der Zellen mittels molekularbiologischen und elektrophysiologischen Methoden sowie in vitro als auch im Tiermodell analysiert werden. Zusätzlich ist geplant, einen neu identifizierten neuralen Oberflächenmarker für die selektive Isolation von Stamm- und Vorläuferzellen zu evaluieren.

Entwicklung neuer kollagener Zellträger (TP 4)

Naturin GmbH & Co. KG Badeniastr. 13 69469 Weinheim

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. Franz Maser 06201 86-360 01GN0969 391.349 EUR 01.06.2009 - 31.05.2012

Für Anwendungen auf dem Gebiet des Tissue Engineering wurde auf Basis von Kollagen ein Zellträger mit neuartigen chemischen und mechanischen Eigenschaften entwickelt. Im vorliegenden Kooperationsprojekt soll dieses Ausgangsmaterial auf die spezifischen Bedürfnisse von Zellbiologen und Chirurgen abgestimmt werden. Es werden daher verschiedene Varianten kollagener Zellträger entwickelt und zur Verfügung gestellt, um dreidimensionale intestinale Gewebekonstrukte zu erzeugen für in vitro-Anwendungen und für Transplantationsexperimente an Tiermodellen mit Störungen im Bereich des enterischen Nervensystems. Aus Rinderhautspalten wird eine extrusionsfähige Kollagenmasse aufbereitet, die zu einem kollagenen Flachfilm und zu tubulären "Minitubes" extrudiert wird. Die resultierenden Produkte werden durch die Einführung von Quervernetzungen, durch Ausrüstung mit bioaktiven Substanzen und durch Plasma-Oberflächenbehandlung modifiziert. Alle Varianten werden umfassend physikalisch/chemisch charakterisiert und den Projektpartnern zur zellbiologischen Evaluierung und für Transplantationsversuche zur Verfügung gestellt. Die Herstellung der Produktvarianten erfolgt interaktiv auf der Basis erzielter Ergebnisse.

Physiologie von Ionenkanälen in humanen enterischen Neuronen (TP 2)

NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut an der Universität Tübingen AG Zellbiologie Markwiesenstr. 55 72770 Reutlingen

Leiterin: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Elke Günther 07121 515-3054 01GN0968 353.251 EUR 01.06.2009 - 31.05.2012

Im Vorhaben werden die Expressionsmuster von Ionenkanälen in differenzierten humanen enterischen neuralen Stammzellen (ENSCs) aus gesundem und pathologischem Gewebe analysiert. Die funktionellen Eigenschaften von ENSCs werden mit denen von gesunden enterischen Neuronen verglichen um eine optimale Differenzierung von ENSCs zu erreichen. Diese differenzierten ENSCs sollen als Quelle für zukünftige stammzellbasierte Therapieverfahren bei spezifischen neurogastrointestinalen Erkrankungen dienen. Die Analyse spannungsgesteuerter Ionenkanäle in enterischen Neuronen von normalen und pathologischen (hypogangliotisch) humanen Darmproben wird mit Hilfe der patch clamp-Technik vorgenommen. Die Analyse der Ionenkanalexpression in differenzierten ENSCs erfolgt zu unterschiedlichen Zeitpunkten in vitro um kultivierungsabhängige Veränderungen in den elektrischen Eigenschaften frühzeitig zu erkennen. Unterschiedliche Differenzierungsprotokolle werden getestet, um eine optimale Expression von Ionenkanälen und eine damit verbundene adäquate Erregbarkeit der Neurone zu erreichen. Die Integarationskapazität von differenzierten ENSCs in glatte Muskulatur wird durch die Analyse der neuromuskulären Erregbarkeit in einer dreidimensionalen Darmgewebekultur untersucht.

Humane Stamm- und Vorläuferzellen des ENS; Charakterisierung von ENS-Stammzellen in vivo (TP 1 und 3)

Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Zentrum für Regenerationsbiologie und Regenerative Medizin Paul-Ehrlich-Str. 15 72076 Tübingen

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. Lothar Just 07071 29-72176 01GN0967 625.831 EUR 01.06.2009 - 31.05.2012

In neuesten Studien wurde die erfolgreiche Gewinnung von enterischen neuronalen Vorläuferzellen aus humanem postnatalem Darm beschrieben. Diese Zellen besitzen das Potenzial, sich in verschiedene ENS-typische neuronale Subtypen und gliale Zellen in der Zellkultur zu entwickeln. Ziel ist eine detaillierte Analyse der zellbiologischen Eigenschaften der menschlichen und murinen enterischen Stamm- und Vorläuferzellen aus gesunden und pathologischen Darmgeweben. Das Ziel von Teilprojekt 1 ist die Charakterisierung des ENS-Stammzellpotenzials in vitro sowie die Entwicklung neuer Zellisolationsstrategien. Dazu sind folgende Arbeitsschritte geplant: Eine detaillierte Analyse der Stammzellkapazität in vitro; die Charakterisierung von FACS-sortierten ENS-Zellen; vergleichende Untersuchungen von Stammzellen, die aus gesundem und pathologischem Darmgewebe gewonnen wurden und die Herstellung von Gewebekulturkonstrukten für die Evaluation der Stammzellkapazität in vitro und für Transplantationsexperimente in vivo. In Teilprojekt 3 soll das Proliferations-, Integrations- und Differenzierungspotenzial von Stammzellen des ENS im Tiermodell analysiert werden. Dazu sollen folgende Punkte bearbeitet werden: Die Etablierung einer humanen Darmgewebebank; die Charakterisierung von humanen und murinen ENS-Stammzellen in vivo; die Entwicklung eines xenogenen Tiermodells.

Verbundprojekt: Spermatogoniale Stammzellen (SSC)

Spermatogoniale Stammzellen sind pluripotente Zellen und werden aus den Tests von adulten Mäusen isoliert, die an Phenylketonurie oder Molybdän-Cofaktor-Defizienz leiden. Dabei handelt es sich um zwei auch beim Menschen vorkommende autosomal rezessiv vererbte Stoffwechselerkrankungen. Es werden klonale Zelllinien etabliert und eine der zwei mutierten Kopien (Allele) wird mit Hilfe der homologen Rekombination durch eine normale Genkopie ersetzt. Die so therapierten SSCs werden in vitro zu Hepatozyten oder entsprechende Vorläuferzellen differenziert. Die Zellen werden in homozygot defiziente Mäuse transplantiert, deren Schicksal und die Immunantwort der Empfänger gegen die tansplantierten Zellen werden untersucht. Sowohl die in vitro generierten Hepatozyten als auch die transplantierten Mäuse werden biochemisch analysiert. Dabei sollen die Funktionsfähigkeit der Zellen und der Therapieerfolg studiert werden. PKU und MOCS1-/- Mäuse stehen hier als Modelle für viele weitere erblich bedingte Stoffwechseldefekte. PKU und MOCS1-/ Mäuse wurden für das Kooperationsprojekt ausgewählt, weil bereits eine kleine Zahl genetisch manipulierter und funktioneller Zellen für die Therapie der biochemischen Defekte ausreichend sein sollte. Nur wenig mehr als 5% Phenylalaninhydroxylase- bzw. Molybdän-Cofaktor-Aktivität sind für die Therapie ausreichend. Die hier exemplarisch angewendete Strategie soll in Zukunft auch für andere erblich bedingte Stoffwechselerkrankungen nutzbar sein, wobei eine individuelle regenerative Therapie realisiert werden kann.

Generierung von homolog rekombinierten SSCs; Herstellung hepatischer Zellen aus maGSCs; Transplantation und Immunologie; Therapeutische Hepatozyten bei Molybdän-Cofaktor-Defizien (TP 1 - 4a)

Georg-August-Universität Göttingen Medizinische Fakultät Zentrum Hygiene und Humangenetik Abt. für Humangenetik Heinrich-Düker-Weg 12 37073 Göttingen

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Wolfgang Engel 0551 39-7589 01GN0966 694.303 EUR 01.06.2009 - 31.05.2012

Die von Partnern dieses interdisziplinären Verbundes bereits erreichten ersten Erfolge in der Isolierung von spermatogonialen Stammzellen werden hier gezielt ausgebaut zur Entwicklung von Therapien für genetisch bedingte Stoffwechselstörungen. Im Teilprojekt 1 werden homolog rekombinierte spermatogoniale Stammzellen isoliert, zu Hepatozyten kultiviert und deren Eigenschaften umfassend charakterisiert. Ziel des Teilprojekts 2 ist das Erarbeiten standardisierter Protokolle für die in vitro-Differenzierung von maGSCs in hepatische Vorläufer und Hepatozyten. Diese werden dann charakterisiert und anhand von Funktionsanalysen getestet. Das Teilprojekt 3 testet die Hepatozyten bzw. hepatozytären Vorläuferzellen als zelluläre Transplantate bei metobolischer Dysfunktion der Leber an Mausmodellen für die Krankheiten Phenylketonurie und Molybdän-Cofaktor-Defizienz. Im Teilprojekt 4 wird die therapeutische Effizienz der hepatisch differenzierten spermatogonialen Stammzellen getestet. Das Teilprojekt 4a prüft die Anwendung im Mausmodell für Molybdän-Cofaktor-Defizienz.

Verbundprojekt: Regeneration mit zellspezifischen Matrices (RECEM)

In diesem Verbund sollen neuartige biphasische Scaffolds auf der Basis von Kollagenen aquatischen Ursprungs entwickelt werden, welche bei der Verwendung von Chondrozyten oder mesenchymalen Stammzellen zu einer vollständigen und dauerhaften chondrogenen Differenzierung führen sollen. Der Knorpel-Teil wird aus Kollagen, das aus Quallen isoliert wird und in Struktur und Zusammensetzung humanem Kollagen Typ II entspricht, bestehen. Der knöcherne Teil wird aus einem Nanokomposit hergestellt werden, der aus Kollagen Typ I, isoliert aus Fischhäuten, und nanoskopischen Hydroxylapatit-Kristallen, besteht. Dieses Nanokomposit ahmt die extrazelluläre Matrix von Knochen nach und beeinflusst mesenchymale Stammzellen in Richtung osteogener Differenzierung. Die Knorpel- und Knochenteile werden zu monolithischen Scaffolds verbunden und sollen als Knorpelersatz vor allem bei Defekten am Gelenkknorpel zur Anwendung kommen.

Knorpel Tissue Engineering mit marinem Kollagen (CarTE) (TP 3)

Universität zu Lübeck Technisch-Naturwissenschaftliche Fakultät Institut für Virologie und Zellbiologie Ratzeburger Allee 160, Geb. 62 23562 Lübeck

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Prof. Dr. Holger Notbohm 0451 500-4083 01GN0964 280.820 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

Ziel dieses Teilprojekts ist der Einsatz von mesenchymalen Stammzellen und/oder Chondrozyten zur autologen regenerativen Therapie. Um diese Zellen zu züchten, wird für die de-novo-Generation des entsprechenden Knorpelgewebes eine Matrix aus Biokompositen hergestellt. Die angestrebte Innovation ist die Entwicklung einer Kollagenmatrix aus marinen Rohstoffen. Der bedeutendste Vorteil von Kollagen aus marinen/wirbellosen Organismen besteht in der Ausschaltung des Risikos der Übertragung von humanpathogenen Erregern wie BSE oder TSE im Gegensatz zu Kollagen aus gefährdeten Wirbeltieren/Säugern. Die Neuartigkeit der zu entwickelnden Kollagenmatrix besteht in ihrem molekularen Aufbau aus Fibrillen, welche die natürliche molekulare Nanotopologie imitieren. Zusätzlich werden neue Erkenntnisse zur Interaktion von Stammzelldifferenzierung und Matrixelastizität beitragen, weshalb der Fokus des Projektes auf der Stammzell-Matrix-Interaktion liegt. Folgende Arbeitspakete werden durchgeführt: AP 3.1: Entwicklung und weitere Verbesserung der technischen Herstellung von Scaffolds aus fibrillärem marinem Kollagen aus Quallen. M1 (5.Q): Fibrilläres Kollagen wird das Scaffold einer Matrix mit optimierter Porengröße und Festigkeit sein, welche den chondrogenen Phänotyp aus hMSC induzieren soll; AP 3.2: Verbesserung der Induktion der Chondrogenese aufgrund gezielter Optimierung der Zellkulturbedingungen. M2 (7.Q): Die Zellkulturbedingungen, welche den chondrogenen Phänotyp stabilisieren, werden definiert; AP 3.3: Untersuchung und Verbesserung der Induktion der Chondrogenese aufgrund gezielter Optimierung der Zellkulturbedingungen; AP 3.4: Verbesserung der Matrixeigenschaften durch die Untersuchung der Matrixfestigkeit und deren Zusammenhang mit dem Stammzellverhalten. M3 (10.Q): Koordination der Ergebnisse der parallel laufenden Untersuchungen zum Einfluss der Matrixfestigkeit sowie zur zyklischen mechanischen Beladung auf die Chondrozytendifferenzierung.

Herstellung von nativem Fisch-Kollagen Typ I (PreFisCo) (TP 2)

Forschungsinstitut für Leder und Kunststoffbahnen gemeinnützige Gesellschaft mit beschränkter Haftung Meißner Ring 1-5 09599 Freiberg

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. Michael Meyer 03731 366-165 01GN0963 308.081 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

Kollagen Typ I ist ein seit langem bekanntes Matrixmaterial für Tissue Engineering. Für 2D-Anwendungen werden meist Kollagenlösungen verwendet, mit denen Kulturgefäße oder auch Implantatmaterialien beschichtet werden. Für dreidimensionale Anwendungen müssen dagegen hochviskose Massen hergestellt werden, aus denen durch Gefriertrocknung geeignete Matrizes gewonnen werden. Bislang wurde zur Herstellung von kollagenbasierten Medizinprodukten meist Rinderkollagen, gewonnen aus Haut oder Sehne verwendet. Mit dem Auftreten von BSE geriet dieses Material jedoch in die Kritik, und es wird nach alternativen Kollagenquellen gesucht. In Teilprojekt 2 sollen daher Aufbereitungsverfahren für Kollagen aus Fischhaut entwickelt werden, um daraus lösliches und unlösliches natives Kollagen Typ I in hoher Reinheit zu gewinnen. Dieses marine Kollagen Typ I soll als Matrixmaterial zur Herstellung der Knochenkomponente der biphasischen Scaffolds verwendet werden. Folgende Arbeitspakete werden durchgeführt: AP1: Rohwarenbeschaffung und deren Charakterisierung; AP2: Rezeptur- und Technologieentwicklung; AP3: Entwicklung geeigneter Zerkleinerungstechnologien; AP4: Charakterisierung der Kollagenmassen; AP5: Entwicklung von Stabilisierungstechnologien und Charakterisierung der damit hergestellten Materialien.

Biphasische Scaffolds aus aquatischen Kollagenen (BiScaff) (TP 1)

Technische Universität Dresden Max-Bergmann-Zentrum für Biomaterialien Institut für Werkstoffwissenschaft Budapester Str. 27 01069 Dresden

Leiter: Tel.: FKZ: Betrag: Laufzeit:

Dr. Michael Gelinsky 0351 463-39370 01GN0962 769.721 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

Basierend auf einem bereits entwickelten Verfahren sollen biphasische, dabei aber monolithische, poröse Scaffolds für osteochondrale Defekte aus aquatischen (marinen) Kollagenen entwickelt werden. Für den chondralen Teil der Scaffolds soll Kollagen verwendet werden, welches aus Quallen isoliert worden ist – und das in Struktur und Zusammensetzung dem humanen Kollagen Typ II ähnlich ist. Für die knöcherne Schicht soll Kollagen I aus Fischhaut benutzt werden, das mit Calciumphosphat mineralisiert wird und damit einen Nanokomposit bildet, welcher die extrazelluläre Matrix von Knochengewebe nachahmt. Dieser Scaffold-Typ soll als Matrix für menschliche mesenchymale Stammzellen (hMSC) verwendet werden, die chondrogen (TP 3) bzw. osteogen differenziert werden sollen. Durch geeignete Porosität und Zellbesiedlungstechniken soll eine homogene Zellbesiedlung sichergestellt werden. Es sollen Kulturbedingungen entwickelt werden, die eine stabile Zell-Differenzierung sicherstellen und zu mechanisch stabilem osteochondralem Gewebe führen. Dabei sollen folgende Arbeitpakete durchgeführt werden: AP1: Entwicklung von biphasischen, dabei aber monolithischen Scaffolds auf der Basis von Kollagenen aquatischen Ursprungs; AP2: Physiko-chemische, mikroskopische und mechanische Charakterisierung der Scaffolds; AP3: Untersuchung geeigneter Zellbesiedelungstechniken und der Zellverteilung in den Scaffolds; AP4: Untersuchung und Quantifizierung der osteogenen Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen im knöchernen Teil des Scaffolds; AP5: Gleichzeitige Kultivierung von chondrogen und osteogen differenzierten hMSC unter Perfusionsbedingungen in den Biphasischen Scaffolds bei zyklischer mechanischer Stimulation. Die CRM (Coastal Research & Management GbR) arbeit im FE-Auftrag in diesem Teilprojekt. Die Leistung der CRM besteht in der Aufarbeitung und geeigneten Behandlung von Kollagen II marinen Ursprungs im Hinblick auf die besonderen Anforderungen als biphasischen Scaffold für den Knorpelersatz. Dabei sollen folgende Arbeitpakete durchgeführt werden: AP1: Etablierung sicherer Bezugsquellen für geeignete Quallen, Charakterisierung des Rohmaterials und Qualitätskontrolle; AP2: Entwicklung einer geeigneten Technologie zur Extraktion, Reinigung und Analyse; AP3: Entwicklung eines Extraktions und Verfahrensprozesses für einen größeren Maßstab, Qualitätsanalyse und Sicherstellung der Reproduzierbarkeit der Kollagene.

 

Autologous Heart Tissue for Myocardial Repair

Cell-based therapies of myocardial diseases are emerging. By providing a new technology to construct force-generating human engineered heart tissue (hEHT), the consortium has contributed to the recent progress in the field. The translation of any cell-based cardiac repair concept is, however, hampered by restricted cardiac differentiation in embryonic stem cells (ESCs) and the paucity of autologous myocardium “repairing” cells. The consortium wants to capitalize on the cardiac-lineage inducing transcription factor MesP1 and of novel non-embryonic, potentially patient-specific pluripotent stem cells; namely spermatogonial stem cells (SSCs), induced pluripotent stem cells (iPSs), and parthenogenetic stem cells (PSCs). Forced-expression of MesP1 is used to induce cardiac lineage determination. Multipotent cardiovascular progenitors as well as cardiomyocytes from genetically naïve and “MesP1-enhanced” SSCs, iPSs, and PSCs are isolated by magnetic cell sorting using antibodies directed against VEGFR2 or a lineage restricted CD4-epitope. Similar experiments are performed with ESCs to enable direct comparisons of embryonic and adult tissue-derived pluripotent stem cells. Finally, the propensity of the different stem cell-derivatives to generate EHT in vitro and to engraft, mature and functionally integrate into native myocardium in vivo either after direct intramyocardial injection or implantation as EHT are assessed. The aim of the consortium is to advance the recently developed cardiac repair concept towards a clinical application.

Cardiac lineage determination and selection (Subproject 4)

Ludwig-Maximilians-Universität München Klinikum der Universität München LIFE-Zentrum - Laser-Forschungslabor Marchioninistr. 23 81377 München

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Wolfgang-Michael Franz +49 89 70953094 01GN0960 225.225 EUR 01.05.2009 - 30.04.2012

Stem cell based cardiac repair will require sufficient yields of cardiac cells for transplantation and tissue engineering. MesP1, the earliest known cardiovascular marker is sufficient to induce cardiogenesis in murine ES cells as recently shown by us. Therefore this subproject aims at MesP1 based “Cardiovascular Forward Programming” of various pluripotent cell types (1. iPS, 2. spermatogonial stem cells, 3. parthenogenic stem cells). In addition to directed differentiation, high-yield isolation of cardiovascular progenitors derived from the same cellular sources via magnetic cell sorting (MACS) using a MesP1-promoter driven CD4 surface marker is pursued. The purified cardiovascular progenitor cells as well as the preprogrammed cardiovascular cells are used for cell transplantation as well as tissue engineering approaches. In addition, biochemical analyses and global whole genome expression array data will supply important novel information on specific intrinsic as well as extrinsic factors, surface markers and pathways involved in cardiogenesis.

Induced pluripotent stem cells for cardiac repair (Subproject 2)

Medizinische Hochschule Hannover Abt. HTG-Chirugie/LEBAO Carl-Neuberg-Str. 1 30625 Hannover

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Ulrich Martin +49 511 532-8820 01GN0958 251.480 EUR 01.05.2009 - 30.04.2012

The goal of this subproject is the development of engineered heart tissue (EHT) based on murine and human iPS-derived cardiomyocytes (CM). The working plan forsees the following steps: a) Derivation of mouse and human cardiovascular progenitors (CVPCs) and cardiomyocytes (CMs) from iPS (embryoid bodies and single cell differentiation); b) characterization of iPS-derived CVPCs and CMs via qRT-PCR, immunostaining, MEA, measurement of intracellular calcium); c) lentiviral transduction to generate selectable iPS/PSC/SSC/ESC; d) lentiviral transduction to express Mesp1 in iPS/PSC/SSC/ESC; e) generation and characterization of iPS-EHT via EM, confocal LSM, force measurements, electrophysiology; e) implantation of murine and human iPS derivatives in healthy and infarcted mice and pigs (analysis of cell survival and integration via immunohistology, functional analyses including MRT and pressure-volume catheter); f) implantation of human EHT in healthy and infarcted mice (analysis as described above); g) allocation of murine and human iPS to other subprojects. After the development of the methodology, it is planned to continue with the development of a vascularised autologous contractile myocardial patch together with Corlife GbR, Hannover.

Parthenogenetic and spermatogonial stem cells for cardiac repair (Subproject 1 and 3)

Georg-August-Universität Göttingen Universitätsmedizin Göttingen Zentrum Pharmakologie und Toxikologie Abt. Pharmakologie Robert-Koch-Str. 40 37075 Göttingen

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Wolfram-Hubertus Zimmermann +49 5139-5781 01GN0957 537.288 EUR 01.06.2009 - 31.05.2012

Subproject 1
Unfertilized oocytes can be chemically activated to form parthenogenetic blastocysts with an inner cell mass containing parthenogenetic stem cells (PSCs). The group could recently demonstrate that murine PSCs can give rise to bone fide cardiomyocytes in vitro and in vivo. The project therefore wants to utilize PSCs in cell-based cardiac repair. Murine and human PSCs are differentiated in embryoid bodies and subjected to magnetic activated cell sorting for VEGFR2+ derivatives. Growth and differentiation potential of the latter are analyzed to identify cardiovascular progenitors. Implantation studies in SCID-mice and in immune-suppressed pigs are performed to assess survival, maturation, and integration of murine and human PSCs as well as derivatives in vivo. Subsequently, the project wants to generate engineered heart tissue (EHT) either from multipotent PSC-derivatives or PSC-derived cardiomyocytes. PSC-EHT morphology and function are compared to genetically naïve and “MesP1-enhanced” SSC-, iPS-, and ESC-EHT. Ultimately, the project establishes an autologous mouse model of PSC-EHT-based cardiac repair and aims at providing large human PSC-EHTs as a “next step” towards a potential therapeutic application.

 

Subproject 3
Cell-based myocardial repair would benefit from the availability of a scalable and autologous surrogate cell source. The group recently identified multipotent adult germline stem cells (maGSCs) from mouse testis. These cells are able to differentiate into functional cardiomyocytes and vascular endothelial and smooth muscle cells in vitro. However, it is unclear, which cardiovascular cell population is transplantable and suitable for repair of the damaged heart without tumorigenicity. Therefore, protocols for differentiation of cells suitable for organ regeneration must be developed before the cells are used to define the proper therapeutic strategy in an animal model. Accordingly, the goals of the present subproject are: 1) the establishment of protocols to generate proliferating cardiovascular progenitor cells (Flk1+ in mouse and KDR+ in human) from mouse maGSCs and from human ESCs and maGSCs; 2) isolation and cultivation of proliferating cardiovascular precursors (Flk1+ in mouse and KDR+ in human); 3) differentiation of the generated Flk1/KDR+ cells into cardiomyocytes and vascular endothelial and smooth muscle cells in vitro; 4) transplantation of mouse Flk1+ cells in mouse hearts with myocardial infarction; 5) histological and functional analyses of transplanted hearts; 6) injection of mouse Flk1+ and human KDR+ cells into SCID-beige mice to study their tumorigenicity. The study intends to help to develop novel treatment strategies for heart failure.

Satellite Cell Network (SatNet) - Fate Determination and Maintenance of Muscle Stem Cells

Healthy adult skeletal muscle has an impressive ability to regenerate, which it does on a daily basis to maintain muscle mass, or in response to injury in order to replace damaged muscle fibres. In congenital and age-related muscle disease, the regenerative potential of muscle stem cells does not suffice to repair or maintain skeletal muscle, due to impaired differentiation, senescence and/or depletion of the satellite cell pool. The consortium investigates the molecular mechanisms and networks that determine satellite cell fate and allow stem cell maintenance and self-renewal. The respective knowledge is a precondition for stimulation of the endogenous satellite cell-mediated repair or for the expansion of cultured satellite cells for a cell-based therapy of muscle disease.

Regenerative potential of muscle stem cells (Subproject 4)

Charité - Universitätsmedizin Berlin Campus Virchow-Klinikum - Klinik für Pädiatrie Augustenburger Platz 1 13353 Berlin

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Markus Schülke-Gerstenfeld +49 30 450 566-468 01GN0956 237.060 EUR 01.07.2009 - 30.06.2012

After removal from the body, satellite cells quickly loose their regenerative potential and die off in cell culture. This is a mayor drawback for the use of myogenic stem cells for cell therapies of congenital muscle diseases. Subproject 4 investigates the signal transduction pathways, which permit myogenic stem cells in vivo to maintain their regenerative potential, to migrate and to fuse with damaged muscle fibres. The aim of the project is to optimize the proliferation potential of satellite cells in vitro. Firstly, it is investigated how Notch- and Wnt-signal transduction pathways in man and mice affect the myogenesis of stem cells and play a central role in different stages of myogenic differentiation. Secondly, it is investigated how the stimulation of the above mentioned signalling pathways under cell culture conditions affects proliferation rate, survival and regeneration potential. For the latter experiment, labelled satellite cells that have been expanded under different culture conditions are transplanted into immunosuppressed mice. It is investigated to which extend these cells contribute to muscle regeneration.

Muscle stem cell determination/maintenance (Subproject 2)

Max-Planck-Institut für Herz- und Lungenforschung (W.G. Kerckhoff-Institut) Parkstr. 1 61231 Bad Nauheim

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Dr. Thomas Braun +49 6032 705-402 01GN0954 254.616 EUR 01.06.2009 - 31.05.2012

Subproject 2 approaches several pathways that most likely control self-renewal, asymmetric cell division, and lineage selection of muscle stem cells and explores the heterogeneity of satellite cells, which are composed of distinct subpopulation of cells owing distinct capacities to regenerate skeletal muscle. The subproject will use a combination of genetic, cell biology and molecular biology techniques to access the epistatic regulation of the afore mentioned regulators and devise new strategies for the manipulation of muscle stem cells. The project is based on the use of transgenic mice and the application of the Cre-recombinase loxP technology. Stem cells and satellite cells are isolated amongst others from muscle fibres. Cells are analyzed by FACS and cultivated under distinct conditions in order to investigate the effects of Notch pathway activation, inhibition of apoptosis and the kinetics of proliferation of muscle stem cells.

RBP-J/Notch and satellite cell fate (Subproject 1) and A transcriptional network defining stemness (Subproject 3)

Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Robert-Rössle-Str. 10 13125 Berlin

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Carmen Birchmeier +49 30 9406-2403 01GN0953 654.724 EUR 01.06.2009 - 31.05.2012

The project is based on the analysis of transgenic mouse lines that have, with one exception, already been generated. In subproject 1, conditional mutants will be generated via Cre recombinase technology to analyze the role of the Notch signalling pathway in the generation and maintenance of satellite cells. Techniques employed will be immunohistochemistry, DNA microarrays and cell culture. Subproject 3 aims to elucidate satellite cell transcriptional networks in order to identify new target genes of known transcription factors. Cultured satellite cells will be analyzed by DNA microarray technology and chromatin immunoprecipitation (ChIP)/high-throughput sequencing (ChIPSeq). Results obtained in the project will in the long-term lead to novel therapeutic strategies for the treatment of degenerative muscle disorders and sarcopenia.

Mesenchymal stem cell mediated preconditioning of human islets

MSZ zur Induktion der Inselzelltoleranz im humanisierten Diabetes Modell

Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Medizinische Fakultät und Universitätsklinikum Zentrum für Kinderheilkunde Abteilung für Pädiatrische Hämatologie und Onkologie Adenauerallee 119 53113 Bonn

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Dagmar Dilloo +49 228 287-33215 01GN0990 367.164 EUR 01.10.2009 - 30.09.2012

MSC-Migration als ein kritischer Schritt in der Toleranz von Allotransplantaten

Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main Institut für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie Sandhofstr. 60528 Frankfurt am Main

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Dr. Reinhard Henschler +49 69 6782191 01GN0952 233.928 EUR 01.05.2009 - 30.04.2012

Rolle der Indoleamin-2.3-dioxygenase (IDO) bei der Interaktion von MSC mit Pathogenen und mit T-Zellen

Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Institut für Medizinische Mikrobiologie, Krankenhaushygiene und Virologie Moorenstr. 5 40225 Düsseldorf

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Walter Däubener +49 211 81-12464 01GN0951 228.528 EUR 01.05.2009 - 30.04.2012

MSZ-vermittelte Konditionierung humaner Inseln

Technische Universität Dresden Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Klinik und Poliklinik III Fetscherstr. 74 01307 Dresden

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Mathias Brendel +49 351 458-4257 01GN0950 227.597 EUR 01.03.2010 - 28.02.2013

Verbesserung von Inselzellüberleben und Inselzellregeneration durch MSC - Therapie

Klinikum der Universität München Campus Innenstadt Diabetes Zentrum Ziemssenstr. 1 80336 München

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Jochen Seissler +49 89 5160-2200 01GN0949 219.225 EUR 01.05.2009 - 30.04.2012

Clinical islet transplantation as biological replacement for the defunct pancreatic insulin-secreting apparatus is a new option for restoration of normogylemia without exogenous insulin injection and associated risk for severe hypoglycaemia. The initially very limited islet graft function has significantly improved over time. A critical obstacle for a broad utilization of islet transplant therapy derives from limited islet yield from a single pancreas and limited survival of intrahepatic islet grafts after transplantion. By now, a number of adverse factors for islet isolation has been identified, comprising upregulation of pro-inflammatory secretion products after brain-death of the pancreas donor and an impaired oxygen supply of islets due to destruction of the capillary network during islet isolation. Both mechanism lead to critical loss of islet mass and function during the culture period immediately prior to transplantation. In addition, there is upregulation of pro-inflammtory proteins within the isolated islets, that further reduce functional survival of the islet graft. This comprises expression of monocyte chemoattraction protein-1 (MCP-1) and tissue factor (TF). Both molecules induce monocyte/macrophage adhesion, neutrophil transmigration and subsequent complement-mediated and cytotoxic destruction of grafted islets. Mesenchymal stem cells from bone marrow have exerted strong anti-inflammtory action in various tissues and pathological inflammatory conditions in animal models and in man, including wound healing, autoimmune encephalitis, myocardial ischemia, renal reperfusion-inuury, ischemia-induced renal deficiency and hepatic fibrosis. Moreover, a support of in-vivo regeneration of islet has been observed in an autoimmune diabetes model (NOD/scid mouse) after therapeutic application of MSC. Findings from the previous grant period have revealed IDO-mediated tryptophane-depltion with consecutive inhibition of alloreacti T-lymphocytes. Simultaneously, paracrine secretion of MSC of growth factors (HGF, VEGF and IGF-1) and other soluble factors can lead to downregulation of proinflammatory cytokines. Tagen together, MSC can modulate inflammation both by cell contact and by secretional products. Althoug MSC have been largely isolated from the bone marrow due to facilitated access, occurrence of tissue-specific MSC has been observed in various tissues, such as fat, skin, muscle, connective tissue and placenta. From these observations, novel markers for SC have been identified, such as CD271. Isolation and characterization of pancreatic MSC (pMSC) has not been performed. Due to the high inflammatory potential of the pancreatic gland both in endogenous and auto-immune pancreatitis it is conceivable, that there pMSC have function characteristics distinctly different from other tissue-specific MSC. Therefore the main aims of the project are: 1. Islet isolation core unit yielding human islets of high functional quality for distribution to the other subprojects in conjunction with assessment of novel isolation technology. 2. Enhancement of resistance of isolated islets against inflammtory stress by coculture with bone-marrow derived MSC or MSC supernatants. 3. Isolation and characterization of pancreatic MSC and evaluation of their capacity to improve islet graft functional survival and revascularization.

iPS and adult bone marrow cells for cardiac repair

Cardiac cell therapy is a promising approach to treat heart disease. Autologous bone marrow cells have some beneficial effects on cardiac function after myocardial infarct, but their cardiac persistence and ability to differentiate into cardiomyocytes (CM) are limited. In contrast, neonatal or fetal CM and CM derived from embryonic stem cells (ES-CM) survive and remain in loco, electrically couple to host CM and support contractility after intramyocardial injection.
The aim of our consortium is to drive cardiac cell therapy one step closer to the edge of clinical application. The following hypotheses will be tested:
1) CM can be obtained from the very promising source of induced pluripotent stem (iPS) cells in sufficient purity to allow cardiac regeneration without tumor formation.
2) iPS cell derived CM (iPS-CM) couple structurally and electrically to host CM in vitro (subproject II) and in vivo after myocardial infarction.
3) Engraftment of iPS-CM is enhanced by optimizing cell application modalities and pre-treatment of cells.
4) iPS-CM improve cardiac function in different states of disease and after different modes of cell application.
5) iPS-CM for cardiac repair are safe and do not lead to tumor formation even when exposed to physical stress.
In addition, we will evaluate the hypothesis that the combination of adult mesenchymal bone marrow cells (MSC) with iPS-CM is an advantageous approach to improve cell deposit (MSC for better adherence), cell survival (MSC for reduction of cell death), electrical and functional integration (MSC for cell coupling), and overall or regional cardiac function without inducing tumor formation. The results of this project will provide important data on the therapeutic potential of IPS-CM and their optimal use. Fetal CM and ES-CM are studied for comparison.

Effect of MSC on tumorigenic potential of iPS-CM

Deutsches Herzzentrum Berlin Berlin-Brandenburg Center für Regenerative Therapien Augustenburger Platz 1 13353 Berlin

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

PD Dr. Christof Stamm +49 30 4593 2109 01GN0948 268.835 EUR 01.03.2009 - 29.02.2012

iPS-derived cell products carry a latent risk of tumor formation. While co-transplantation of MSC with iPS-derived cardiomyocytes (iPS-CM) should facilitate graft survival, integration, and function by various paracrine effects including MSC-induced immunomodulation, it must be excluded that immunosuppressive actions of MSC unmask or trigger tumor formation by iPS-CM. The effects of physical stressors and of MSC-induced immunmodulation on the likelihood of iPS-CM-induced tumor formation will be addressed. In vitro, the response of iPS-CM to hypoxia and oxidative stress will be studied and compared with that of native adult and neonatal CM. Particular attention will be paid to interference of the cellular stress response with stemness-encoding transgenes. The impact of MSC on these phenomena will be determined. In vivo, iPS-CM will be implanted in immunocompetent mice with or without local or systemic delivery of MSC. The dose of both cell types will be systematically increased, and the frequency of unwanted CM proliferation or tumor formation recorded. Finally, the response of iPS-CM and iPS-CM/MSC transplanted hearts to secondary ischemic injury will be studied in vivo. The results will allow concluding whether concomitant delivery of iPS-CM and MSC increases the risk of tumorigenesis in the heart under baseline conditions, and whether the grafts remain stable when faced with secondary stressors.

iPS cell-derived cardiomyocytes, 2) in vitro analysis of integration, 3) enhancing iPS-CM engraftment, 4) electrical integration of iPS-CM in vivo and 5) iPS-CM and MSC: in vivo evaluation

Universität zu Köln Medizinische Fakultät Universitätsklinikum - Institut für Neurophysiologie Robert-Koch-Str. 39 50931 Köln

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Jürgen Hescheler +49 221 478-6960 01GN0947 1.264.376 EUR 01.03.2009 - 29.02.2012

1) Recent conversion of adult somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells may offer new opportunities for patient-specific cell replacement therapies. We have generated a transgenic iPS cell line in which the expression of EGFP and puromycin-resistance genes is driven by a cardiospecific alpha-myosin heavy chain promoter. This line allows for generation of pure cardiomyocytes (CM), their analysis in the absence of other cell types and in vivo tracking. We will support functional analyses by other partners by supplying standardized iPSCM preparations and will describe their basic molecular and immunologic properties. 2) Transplantation of cardiomyocytes (CMs) improves the function of injured hearts. Induced pluripotent stem cells are a promising source for CMs. For clinical application, functional and structural integration will be necessary. In a model we analyze morphological and functional integration of transplanted cells under controlled conditions. The influence of a co-transplantation of mesenchymal stem cells (MSCs) will be investigated. Slices of embryonic mouse hearts will be used either as viable tissue or after oxygen–glucose deprivation to simulate ischemia. Furthermore, pharmacologic tests as well as intracellular action-potential recordings by sharp-glass electrodes will be performed. 3) Cardiac cell therapy is a promising new approach to treat heart disease. Neonatal or fetal cardiomyocytes are effective in replacing lost cardiomyocytes and improving cardiac function when injected into infarcted hearts. We will develop modalities of cell application and pre-treatment of cells which allow the efficient replacement of injured myocardium in vivo using cardiomocytes derived from induced pluripotent stem cells (iPS-CM). Graft effect, graft size and grafted cell survival will be determined by histology, as well as with FISH and quantitative PCR for specific genetic markers. 4) Electrical integration and maturation of iPS-CM and the impact of a cotransplantation of MSC will be investigated. iPS-CM expressing eGFP and a puromycin resistance will be purified and transplanted, either alone or mixed with MSC, into infarcted murine hearts. After 6, 9 or 12 days, viable short axis slices of recipient hearts will be prepared and analyzed. Thereby we will extend our knowledge of the mechanisms underlying cell therapy using iPS-CM. 5) While fully differentiated cardiomyocytes show poor engraftment into the host tissue after transplantation, the positive effects of bone marrow derived stem cells, observed in clinical trials, seem to be caused solely by paracrine properties. The efficacy of combined transplantation (iPS-CM and bone marrow mesenchymal stem cells, MSC) will be investigated. The effects of the combined cell therapy will be evaluated in a NOD/SCID mice model, where ischemic and non-ischemic cardiomyopathy was induced previously. We will shed light on the impact of adult stem cells as co-factors that augment the efficacy of cell therapy for cardiac regeneration.

Regenerative potential of mesenchymal stem cells (MSC)

We would like to use the increasing knowledge of the molecular regulation of MSC proliferation and differentiation to specifically explore the potential of human MSC. We will focus on the immunogenicity and the immunomodulatory effects of autologous vs. allogeneic MSCs and their modulation by clinically relevant immunomodulatory agents and extracellular matrices to define the most promising tools for regenerative therapy. This aspect will be of relevance for testing the possibility to improve the engraftment and survival of pancreatic islet grafts. The role of MSC within various stem cell niches will be studied by a molecular analytical project in which signalling pathways activated in or by MSC (e.g. BMP, Hedgehog, Wnts) can be detected by a fluorescence based reporter assay. Since the proliferation and biological function of MSC can be modified by the way of isolation and the culture carrier used for expansion, experiments will focus on the regenerative and trophic effects of purified MSC subsets cultured/expanded on bioactive polymer scaffolds. We like to address whether the osteogenic potential of MSC can be enhanced by the use of bioactive substrates. Beside this we investigate the in-vivo regeneration of bone mediated by mesenchymal stem cells in a zebra-fish model.

Materials to control MSC in culture

Leibniz-Institut für Polymerforschung Dresden e.V. Hohe Str. 6 01069 Dresden

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Dr. Carsten Werner +49 351 4658-531 01GN0946 108.332 EUR 01.05.2009 - 30.04.2012

In addition to soluble factors, the adjustment of physicochemical constraints of cellular microenvironments offer valuable options to control proliferation and differentiation of MSCs in vitro. Most notably, the coupling mode of extracellular matrix (ECM) components to carrier materials, the topology and mechanical properties of the ECM are critical factors. The project aims to provide artificial scaffolds with varied elasticity for the ex vivo MSC culture to modulate the specificity of cell adhesion ligands and their coupling mode. Based on synthetic and biohybrid polymeric hydrogels these scaffolds shall be utilized for three tasks in MSC culture: 1) isolation and 2) ex vivo expansion of multipotent MSC, 3) controlled pre-differentiation of MSC to support the ex vivo expansion of specific cell types prior to transplantation.

1) Immunosuppressive capacity and immunogenicity of MSC, 2) MSC in islet transplantation, 3) MSC in zebrafish fin regeneration, 4) imaging Mesenchymal Stem Cell Signalling and 5) materials to control MSC in culture

Technische Universität Dresden Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus Fetscherstr. 74 01307 Dresden

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Martin Bornhaeuser +49 351 458-4704 01GN0945 1.010.561 EUR 01.05.2009 - 30.04.2012

1) (MSCs) emerged as promising candidates for novel therapeutic approaches aimed at the inhibition of immune responses. In addition, the extraordinary capacity of MSCs to differentiate into various cell types has prompted consideration to their therapeutic potential in tissue engineering. One major goal is to compare the immunosuppressive capacity of autologous and allogeneic human MSCs. Thus, the impact of MSCs on proliferation, cytokine production and cytotoxic activity of T cells and natural killer (NK) cells will be investigated. In addition, the ability of MSCs to induce regulatory T cells and to influence the immunostimulatory capacity of dendritic cells will be analyzed. To get novel insights into the immunogenicity of MSCs, the cytotoxic potential of CD8+ T cells and NK cells against autologous or allogeneic MSCs will be compared. Finally, we will evaluate whether clinically relevant immunomodulatory agents and different extracellular matrices influence the immunosuppressive capacity and immunogenicity of MSCs. 2) Transplantation of pancreatic islets into the liver is a potential cure for type 1 diabetes. Although successful in the short term, 5-year insulin independence is currently only 10%. Co-transplantation of MSC with pancreatic islets substantially improves the outcome of islet transplantation in a mouse model. We will determine the mechanism by which MSC provide help to islet beta cells so that the niche can be recreated. We will determine whether MSC improve islet graft function via increasing beta cell survival and/or renewal; determine the relevance of basement membrane and endothelial cells in the MSC help using integrin and VEGFR deficient models; and develop an MSC-islet 3D matrix assisted culture for transplantation. Experimental models include a syngeneic minimal mass islet transplantation model in the mouse, and in vitro co-culture of human MSC and islets. 3) MSC are the precursors of osteoblasts and therefore have great potential for the development of cellular regenerative therapies of damaged bone. In order to further advance the development of MSCs as osteoblast precursors for therapies, we should learn more about the regulation of MSCs in vivo, in particular along the osteoblast lineage. In contrast to mammals, fish and amphibia have the remarkable capacity to regenerate many organs after major tissue loss or damage. During zebrafish fin regeneration, the bony rays of the fin are re-formed from a mass of mesenchymal stem cells in a process closely resembling intramembranous bone formation. The signaling pathways regulating osteoblast precursor proliferation and differentiation are conserved between fish and mammals; thus the regenerating zebrafish fin provides an excellent model to study the niches that control signal delivery to osteoblast precursors. 4) MSCs can augment regenerative responses to tissue damage even when their progeny do not engraft. Instead, they are thought to provide growth factor signals aiding the tissue repair process. We would like to understand at the subcellular level how, when, and where signals are transduced from MSCs towards cell types known to benefit from MSC coadministration during experimental regenerative therapy, using the communication between MSCs and HSCs for comparison. We will image activation of key signalling pathways (e.g. BMP, Hedgehog, Wnt) live and at subcellular resolution. We will thereby map the signalling events by which MSCs in vivo augment regeneration processes mediated by unrelated stem cell pools. 5) The adjustment of physicochemical constraints of cellular microenvironments offer valuable options to control proliferation and differentiation of MSCs in vitro. Most notably, the coupling mode of extracellular matrix (ECM) components to carrier materials, the topology and mechanical properties of the ECM are critical factors. The project will provide artificial scaffolds with varied elasticity for the ex vivo MSC culture to modulate the specificity of cell adhesion ligands and their coupling mode. Scaffolds shall be utilized to optimize MSC culture fro sepcial tasks.

START-MSC2; Standardization for Regenerative Therapy – Mesenchymal Stem Cells

The lack of common standards for preparations of stem cells and of differentiated cells derived thereof has remained a major obstacle for progress in cell-based therapy. For mesenchymal stem cells (MSC), the quality of preparations from different laboratories varies tremendously. Within the past 3 years this consortium has established optimized protocols for preparation of MSC, developed tools and a catalogue of markers for precise characterization, defined the impact of cellular senescence on their potential, and studied their differentiation potentials in vitro, in a blastocyst injection and in animal models. We have demonstrated that albeit optimized MSC preparations were able to differentiate into bone, cartilage and adipose tissues, there is no evidence that they can differentiate into liver or cardiac cells. However, the induction of pluripotency by introducing defined genetic factors into somatic cells has opened new horizons. Considering these developments, we propose in Start-MSC2 to verify and establish guidelines for quality control of optimized MSC preparations and compare them with genetically manipulated counterparts, such as iP-MSC. We will pursue the following goals: 1. Development of standard procedures and guidelines for the safe and efficient production of human MSC under GMP-conditions. 2. Application of optimized and standardized MSC-preparations as a surrogate niche-model for hematopoietic stem cells. 3. Impact of replicative senescence upon gene expression, junctional complexes and functional properties of MSC.  4. Identification of differentiation mechanisms and development of reprogrammed MSC with induced pluripotency.

In vitro and in vivo characterization of hepatic progenitor cells derived from standardized pluripotent/multipotent human MSC populations

Medizinische Hochschule Hannover Zentrum Innere Medizin Abt. Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie Carl-Neuberg-Str. 1 30625 Hannover

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Michael Ott +49 511 532-3712 01GN0944 221.676 EUR 01.03.2009 - 29.02.2012

Since isolated adult hepatocytes from donor organs for liver cell therapy are limited, liver cells derived from adult stem cells would be an attractive alternative cell source. In the previous program period published protocols for the differentiation of human mesenchymal stem cells (MSC) into cells of the hepatic lineage have been established and analyzed according to the proposed catalogue of molecular, functional and biological markers. Although hepatic gene and protein expression was detected after application of hepatic differentiation protocols, transplantation of the cells did not result in liver tissue formation in animal models. Recent evidence, however, suggests that pluripotency/ multipotency is restricted to small subpopulations of MSC preparations or may be induced by cell culture methods (MAPC) as well as multiple transductions with “stemness” genes (induced pluripotent stem cells, iPS). With our optimized and standardized MSC preparations as targets, we will define MSC subpopulations or induce pluripotency (iP-MSC) and will develop differentiation protocols to induce a hepatic phenotype in these cell populations. We will apply existing tools and protocols for the selection of cells with hepatic phenotype and characterize the cell fractions by molecular and functional markers. Finally we will transplant the cells into various immunodeficient mouse models, which facilitate the formation of liver tissue.

MSC developmental potential

Julius-Maximilians-Universität Würzburg Medizinische Fakultät Institut für Medizinische Strahlenkunde und Zellforschung (MSZ) Versbacher Str. 5 97078 Würzburg

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Albrecht Müller +49 931 201-45848 01GN0943 251.460 EUR 01.03.2009 - 29.02.2012

Goal of this project is to analyze the in vivo developmental potential of human mesenchymal stem cells (hMSCs) and of iP-MSCs (induced pluripotent stem cells derived from hMSCs) by blastocyst injection. Particularly we are interested in determining which clinically relevant cell types can be generated by hMSCs and iP-MSCs. To this end we are injecting fat tissue-derived hMSCs and iP-MSCs into murine blastocysts. Subsequently the different cell types of hMSC/iPMSC origin are identified in various tissues of chimeric embryos and adult animals by human-specific DNA in situ hybridizations and by cell type-specific Immunohistochemistry within. As the differentiation potential of hMSCs alters during cultivation we are also interested in the epigenotype of short and long term cultured hMSCs. Here we are focusing on the epigenotype-modifying proteins of the polycomb group as they play an essential role during cellular aging and for the determination of the cellular identity.

Molecular Differentiation Markers for Cardiomyogenesis, Hepatocytogenesis, Adipogenesis and Interstitial Cells

Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ) Institut für Zell- und Tumorvirologie Abt. Zellbiologie Im Neuenheimer Feld 280 69120 Heidelberg

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Werner Franke +49 6221 42-3212 01GN0942 324.456 EUR 01.03.2009 - 29.02.2012

Progress, safety and clinical success of the joint effort will essentially depend on the purity, homogeneity and safety of the mesenchymal stem cell (MSC) preparations from human bone marrow, umbilical cord blood or adipocytes and from their induction to differentiate along desired pathways, i.e. notably cardiomyogenesis and hepatogenesis, and specifically on the selection, enrichment and characterization of the desired types of differentiated cells. To this end, decisive molecular markers for the differentiated state will be defined and specific monoclonal antibodies (mAbs) against them will be prepared and characterized that will allow to identify and enrich the desired cell types and to determine the specific "fate maps" to control and monitor their correct state of differentiation. It is also crucially important to detect and preparatively eliminate cells with unwanted properties, including adipogenic, smooth muscle-like and fibroblastoidal cells as well as malignantly transformed cells. The selected mAbs will then be made available to all partners in the consortium and to pathology in general.

Differentiation Mechanisms & Reprogrammed MSC

Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Robert-Rössle-Str. 10 13125 Berlin

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Dr. Daniel Besser +49 30 9406-2488 01GN0941 311.720 EUR 01.03.2009 - 29.02.2012

The initial goal of the START-MSC consortium was to establish the standardization of mesenchymal stem cells (MSC) and protocols for their differentiation to cardiomyocytes and hepatocytes. However, differentiation of target cell types was not successful following a variety of protocols. On the other hand, using human embryonic stem cells, which are currently not applicable in clinical settings, these differentiation paradigms can be observed. Thus, we are now trying to combine the use of MSC with induction of pluripotency. Induced pluripotent MSC (iP-MSC) might be able to differentiate into non-mesenchymal tissues. To this end, it has recently been reported that pluripotency can be induced by the expression of four transcription factors. We recently succeeded to derive induced pluripotent stem (iPS) cells from mouse embryonic fibroblasts. We are in the process of following similar protocols with human fibroblasts and MSC. Using the optimized MSC preparations from subproject 1 (Towards GMP-Processing: Banking, Characterization and GMP-Manufacturing of MSC) gives us the unique opportunity to derive iP-MSC from defined cell pools. In a second part of this project the molecular processes required for cardiomyogenesis and hepatogenesis in the induced pluripotent cells will be studied in detail with regard to signaling events and gene regulation. This project will allow us to evaluate whether iPS cells derived from somatic cell types can be a functional alternatives for cell replacement therapies.

Gene and protein profiles of human MSC subsets

Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Medizinische Fakultät und Universitätsklinikum Heidelberg Medizinische Klinik - Innere Medizin V Hämatologie, Onkologie und Rheumatologie Im Neuenheimer Feld 410 69120 Heidelberg

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Anthony D. Ho +49 6221 56-8001 01GN0940 349.989 EUR 01.03.2009 - 29.02.2012

In this subproject we propose a molecular characterization of human mesenchymal stem cells (MSC) by microarray analysis and proteomics to evaluate reproducibility in their gene and protein expression profiles. Comparison with differentiated cardiomyocytes and hepatocytes will elucidate molecular characteristics of MSCs versus differentiated cells. In the last funding period we have identified the genetic signatures of MSC and have correlated the genomic data with their functional properties. We systematically standardized and refined the isolation- and culture-techniques. Albeit these optimized MSC have important supportive function for other stem cells and progenitors, they did not show evidence of pluripotency. In continuation of our line of research, we will establish genetically modified MSC (induced pluripotent MSC, iP-MSC). We will analyze the genome and protein profiles of iP-MSC versus optimized MSC. In addition, we will characterize the homotypic intercellular junctions among these cells. Specific molecular patterns and junctional complexes might be associated with pluripotency. Subsequent correlations of gene and protein profiles with junction complexes, and with data generated by functional assays in subprojects 5 (murine blastocyst injection model) and 6 (hepatic differentiation) will provide significant knowledge on mechanisms inducing differentiation in specific pathways.

Towards GMP-Processing: Banking, Characterization and GMP-Manufacturing of MSC

Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Fakultät für Klinische Medizin Mannheim Institut für Transfusionsmedizin und Immunologie Friedrich-Ebert-Str. 107 68167 Mannheim

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Dr. Karen Bieback +49 621 383-9720 01GN0939 229.056 EUR 01.03.2009 - 29.02.2012

Human Mesenchymal Stromal Cells (MSC) are key candidates for cellular therapies ranging from regenerative medicine, hematopoietic/stromal support to immune modulation and gene therapy. Enhancing the proliferation without inducing early replicative senescence and loss of differentiation potential under GMP-compliant manufacturing conditions will be the key issue of our work within this funding period. Based on the expertise gained within the first funding period, we propose:
- To extend and optimize the bank of standardized human Mesenchymal Stromal Cells (MSC) derived from different human tissues providing traceable cell lots to the cooperating partners for further analyses. In addition, to expand and provide iP-MSC and quality control these compared to MSC. This necessitates developing potency assays testing function and test assays ensuring safety.
- To further dissect the molecular pathways of adipogenesis and osteogenesis: Strikingly, cord blood MSC have a higher osteogenic but reduced adipogenic differentiation capacity, which seems to be related to the selective expression of pre-adipocyte factor-1, an inhibitor of adipogenesis.
- Finally, to further develop GMP-compliant manufacturing conditions optimized for MSC, iP-MSC and possible MSC subsets. This includes characterizing in detail the molecular basis for differential effects of different human alternatives on MSC derived from different tissue sources as well as their role on adhesive behaviour of MSC.

Pluripotent Cells for Heart Therapies

The socioeconomic burden of cardiovascular diseases and the principal feasibility of therapeutic cell applications in the treatment of acute heart infarctions give important reasons for studying patient-derived stem cells as possible sources for transplantation approaches. During the current first funding phase we aimed at using fusion hybrid cells to obtain patient-derived pluripotent stem cells that can be used in regenerative cardiac medicine. However, we did not succeed in generating true diploid patient-derived cells from the tetraploid fusion hybrids. Nevertheless, we provided important new insides in the molecular mechanisms of somatic cell reprogramming and in the characteristics of fusion hybrids during mesodermal / cardiac cell differentiation. Moreover, we established an active, interacting consortium of renowned research groups with comprehensive expertise in the field of stem cell-based therapeutic applications for cardiac diseases. Amongst the recent achievement of the Max Planck Institute for Molecular Biomedicine in Muenster (MPI-MBM) the generation of truly pluripotent stem cells, derived from murine testis biopsies, offers a promising new cell resource for patient-specific therapeutic approaches. Therefore, we propose to analyze the potential of these pluripotent germline stem cells (pGSC) with respect to their cardiac differentiation capacity, their immunological characteristics, and their significance as source for cardiac cell transplants. Furthermore, we aim to generate porcine and human pGSC for the evaluation in pre-clinical large animal models of the pig to finally provide a cell therapeutic strategy for future phase-I clinical trials.

Transplantation of pGSC-derived cardiac cells

Westfälische Wilhelms-Universität Münster Universitätsklinikum Medizinische Klinik und Poliklinik Albert-Schweitzer-Str. 33 48149 Münster

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Sigrid Nikol +49 251 83-48501 01GN0938 232.767 EUR 01.03.2009 - 29.02.2012

The socioeconomic burden of cardiovascular diseases and the principal feasibility of therapeutic cell applications in the treatment of acute heart infarctions give important reasons for studying patient-derived stem cells as possible sources for transplantation approaches. Therefore, we propose to analyze the potential of pluripotent germline stem cells (pGSC) with respect to their cardiac differentiation capacity, their immunological characteristics, and their significance as source for cardiac cell transplants. Furthermore, we aim to generate porcine and human pGSC for the evaluation in pre-clinical large animal models of the pig to finally provide a cell therapeutic strategy for future phase-I clinical trials. The specific goals of subproject 5 are (1) to differentiate murine, porcine and human pGSCs into cardiopoietic / cardiomyocyte-like cells in vitro and (2) to transplant these into infarcted mouse and pig hearts to evaluate their regenerative potential by the investigation of functional, structural and biochemical parameters. The techniques that are developed in this project will provide a major progress in the generation of patient-derived pluripotent cells. All results will be published in high-ranking journals after issues of patent claims or licensing are appropriately addressed.

pGSC-CM: Immunogenetic and functional properties

Universität zu Köln Medizinische Fakultät – Universitätsklinikum Institut für Neurophysiologie Robert-Koch-Str. 39 50931 Köln

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Jürgen Hescheler +49 221 478-6960 01GN0937 225.225 EUR 01.03.2009 - 29.02.2012

The most important prerequisite for clinical application of pGSC-derived cardiomyocytes (pGCS-CM) is that they possess all functional properties required for successful heart repair and that they engraft permanently upon transplantation without being lost due to suboptimal delivery, apoptosis or immune rejection. The main objectives of this subproject are to a) characterize functional properties of pGSC-CM; b) determine their immunological properties in vitro; c) optimize their long-term engraftment in vivo; and d) determine their immunogenicity across histocompatibility barriers. These studies will clarify whether pGSC-CM possess functional properties required for replacement of damaged CM in diseased heart, elucidate their immunogenicity and develop optimized protocols for enhancement of their long-term engraftment in infarcted myocardium. Comparison of pGSC-CM properties to those of ES-CM and iPS-CM will provide important clues about the best source of CM for cardiac repair.

Cardiac in vitro differentiation of pGSC

Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Medizinische Fakultät und Universitätsklinikum Institut für Physiologie I Sigmund-Freud-Str. 25 53115 Bonn

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Bernd Fleischmann +49 228 6885-202 01GN0936 235.725 EUR 01.03.2009 - 29.02.2012

Subproject 3 is involved in the generation of cardiomyocytes from pGSCs. The function of these cells and especially their clinical potential for the therapy of heart diseases are analysed in vitro and in mouse models.
During the first year, transgenic pGSC-lines are established allowing the identification and purification of differentiated cardiomyocytes. During the second year, these cells will be cell-biologically and functionally characterised and finally, during the third year, used for electrophysiological studies and transplantations in vitro and in vivo. We aim for publication of our findings in high-ranking journals and a patent registration of the acquired techniques. The results of small animal- and large animal models should be transferred to clinical phase I studies in the foreseeable future. Thereby, with these methods an improvement of the treatment of cardiac diseases can be expected in the long term. Moreover, it will be possible to implement stem cell banks utilizing immunocompatible pGSC-lines.

Evaluation of porcine pGSCs

Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Institut für Nutztiergenetik Höltystr. 10 31535 Neustadt am Rübenberge

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Heiner Niemann +49 5034 871-148 01GN0935 275.400 EUR 01.03.2009 - 29.02.2012

The main goal of this subproject is to explore the therapeutic potential of porcine pluripotent cells such as germline stem cells (pGSCs) that have recently been isolated from mouse adult testis by Partner 1 of this consortium. The pig is an important large animal model for biomedical research and pGSCs have not been developed in other species than the mouse. Here, we propose to generate porcine pGSCs, and to assess the suitability of this stem cell type for cell replacement therapies. Porcine pGSCs will be characterized with respect to expression of stemness related genes, growth pattern in vitro, chromosomal stability, capacity for directed and spontaneous differentiation as well as for teratoma formation in immunodeficient mice. Specifically, the differentiation potential of porcine pGCS into cardiomyocytes, and the usefulness of their transplantation in an infarction model will be evaluated. The successful use of pGSCs avoids ethical concerns related to the use of human embryonic stem cells in research and could thus be a promising tool for an ethically acceptable approach for cell therapies in human patients.

Pluripotent germline stem cells

Max-Planck-Institut für molekulare Biomedizin Röntgenstr. 20 48149 Münster

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Hans Schöler +49 251 70365-30 01GN0934 253.968 EUR 01.03.2009 - 29.02.2012

The socioeconomic burden of cardiovascular diseases and the principal feasibility of therapeutic cell applications in the treatment of acute heart infarctions give important reasons for studying patient-derived stem cells as possible sources for transplantation approaches. Therefore, we propose to analyze the potential of pluripotent germline stem cells (pGSC) with respect to their cardiac differentiation capacity, their immunological characteristics, and their significance as source for cardiac cell transplants. Furthermore, we aim to generate porcine and human pGSC for the evaluation in pre-clinical large animal models of the pig to finally provide a cell therapeutic strategy for future phase-I clinical trials. Subproject 1 will provide a platform generating murine pGSC from wild-type and transgenic mice for the entire consortium and will transfer the approach of generating spermatogonial stem cells (SSC) from human testicular biopsies. These human SSC will be cultured in defined medium conditions to evaluate the necessary components for their conversion into truly pluripotent germ-line stem cells (pGSC). The techniques that are developed in this project will provide a major progress in the generation of patient-derived pluripotent cells. All results will published in high-ranking journals after issues of patent claims or licensing are appropriately addressed.

Cord Blood-HEmatopoietic stem cells: Reliable Methods for ex-vivo ExpanSion

Lifelong blood production depends on haematopoietic stem cells (HSCs) and their ability to self-renew and to differentiate. Cord blood (CB) banking is continually increasing due to the superior properties of CB compared to adult HSC. However our inability to expand HSCs renders insufficient stem cell numbers, a major constraint in many settings of CB-HSC transplantation. Despite optimization of isolation and processing techniques this restricts CB-HSC transplantation mainly to paediatric patients. New methods that generate sufficient numbers of HSCs from limited input cells are needed to make CB-HSCs available to adult patients and amenable to advanced cell and gene therapy approaches in regenerative medicine. Therefore, the aim of this consortium is to open CB-HSCs to new therapeutic applications by developing controlled strategies for expansion and transplantation. Specifically we plan to apply novel growth factor cocktails, nano-structured 3D surfaces, modifications of inhibitory pathways and epigenotype and specific stroma environments in order to expand and regulate HSCs ex vivo. The first clinical application of novel strategies developed by us is in the context of allogeneic CB-HSCs transplantation for elderly patients suffering from haematopoietic disorders. Overall goal: to broaden the therapeutic application of CB-HSCs by developing robust means that allow significant HSC expansion and better engraftment. Specific aims: 1) to develop rational and robust means of ex vivo CB-HSC expansion: by novel growth factor cocktails, nano-structured 3D surfaces, modification of inhibitory pathways, induced epigenetic modifications and by specific stroma environments; 2) development of clinically applicable standard operating procedures for CB-HSC expansion using CD34+ cells isolated from umbilical cord blood; 3) eludicate molecular pathways and intercellular networks operating in HSC ex vivo expansion cultures; 4) exploring genetic, epigenetic and functional integrity of expanded cells in vivo.

Expansion of CB-HSCs with human MSCs

Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen Fakultät 10 Medizin und Universitätsklinikum Institut für Biomedizinische Technologien - Lehrstuhl für Zellbiologie Pauwelsstr. 30 52074 Aachen

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Dr. Wolfgang Wagner +49 241 80-80759 01GN0933 225.225 EUR 01.05.2009 - 30.04.2012

The use of umbilical cord blood (CB) for transplantation is restricted by the small number of hematopoietic stem cells (HSC) available in each cord blood unit. A strategy to overcome this problem is ex vivo expansion of HSC by co-culture with mesenchymal stromal cells (MSC). The CD34+ cell fraction of hematopoietic stem and progenitor cells (HPC) will be isolated from CB. Furthermore, MSC will be isolated form the bone marrow of young and elderly donors. MSC give rise to the cellular components and extracellular matrix of the natural stem cell niche and thus, they might provide a suitable in vitro system for expansion of primitive HSC. In these experiments we will analyze proliferation of HPC, maintenance of primitive immunophenotype and their colony forming unit potential after co-culture with MSC. Engraftment and long-term repopulating potential will then be analyzed in the murine NOD/SCID transplantation model. Milestones are: 1) The comparison of different co-culture methods of HPC and MSC. Therefore, MSC will be either grown in different culture media on plastic surfaces or with microcarrier systems. 2) The impact of long-term culture and aging of MSC on maintenance and expansion of primitive HPC will be determined. 3) Epigenetic modifications (methylation of DNA and histone acetylation) in HPC will be analyzed upon culture either with, or without MSC. These studies will focus on the question, if co-culture with MSC is suitable for clinical expansion of CB-HSC. We expect that this interaction induces epigenetic changes that might further elucidate regulation of self-renewal and differentiation of stem cells. The results will be compared with other strategies for expansion of HSC within this consortium. This research might facilitate reliable CB transplantation for elderly patients.

Epigenetic characterization of CB-HSCs and SP6: Coordination and Administration

Julius-Maximilians-Universität Würzburg Medizinische Fakultät Institut für Medizinische Strahlenkunde und Zellforschung (MSZ) Versbacher Str. 5 97078 Würzburg

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Prof. Dr. Albrecht Müller +49 931 201-45848 01GN0932 263.556 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

A prerequisite for the broader application of CB-HSCs is their efficient and safe expansion. Here in this subproject it is planned 1.) to establish the global epigenotype of CB-HSCs; 2.) to study the expression of stem cell-specific genes and characterise their epigenotype. 3.) Finally it is planned to asess the functional consequences of epigenetic perturbation of histone acetylation levels on HSC function. HSCs from CB will be isolated using methods that are standardised within the CB-HERMES consortium. Briefly, fresh human CB (less than 24h old) is taken using the guidelines approved by the local Ethic Committees. Mononuclear cells are isolated by density gradient centrifugation on Ficoll-hypaque. CD34+ cells are enriched by labeling with a monoclonal anti-CD34 antibody conjugated with magnetic MicroBeads. Further purification of CD34+ or CD34+/CD38- cell fractions will be achieved by cell sorting. Cells will be cultured ex vivo (5, 10, 20 days) in the presence of SCF, TPO, FGF-1, Angiopoietin-like 5, heparin and IGFBP2 and increasing concentrations of HDAC inhibitors TSA or SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid). The influence of TSA or SAHA treatment will be analysed on gene expression of self-renewal genes using quantitative RT PCR, on cell death and on chromatin modification. The functional consequences of HDAC inhibitor treatment will be assayed by multilineage colony (CFC) assay and by transplantation of untreated and treated cells into irradiated NOD/SCID-C mice followed by flow cytometric analysis using human cell lineage-specific antibodies. We predict to gain further insights into the epigenotype of CB-HSCs and to develop alternative methods for efficient HSC expansion and differentiation to provide autologous tissue for cell replacement therapies. However, a full characterization of the safety and efficacy of the hPG cells is first necessary for the development of safe patient-specific cell lines. The results will be presented in scientific meetings, patented when possible and published in international peer-reviewed journals.

Biomaterial scaffolds for CB-HSC expansion

Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen Fakultät 10 - Medizin und Universitätsklinikum Institut für Pathologie Pauwelsstr. 30 52074 Aachen

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Dr. Sabine Neuß-Stein +49 241 80-80622 01GN0931 280.872 EUR 01.03.2009 - 29.02.2012

CB-HSC and MSC from umbilical cord Wharton´s Jelly are analyzed in a standardized manner employing our established biomaterial test with 2D polymers. Read-out parameters are: cell adhesion, vitality, proliferation, cytocompatibility and apoptosis. Polymers, which are identified as being optimal for both cell types, are then produced as 3D structures by foaming or electrospinning. Native or functionalized 3D polymers are then used to expand CB-HSC in vitro. The polymers will be functionalized by covalently bound growth factors / cytokines or by preseeding with MSC to mimic the bone marrow niche of HSC. Scaffold-expanded CB-HSC will then be xenotransplanted into a NOD/SCID-gc mouse model to analyse long-term HSC growth and differentiation in vivo. It is expected to develop an in vitro expansion system for CB-HSC. The system will be developed for clinical uns and patented and we plan to present the results in national and international scientific meetings and to publish the data in international peer-reviewed journals.

Pathway discovery and protocol development and SP5: Clinical application of CB-HSCs

Medizinische Hochschule Hannover Abt. Hämatologie, Hämostaseologie und Onkologie Carl-Neuberg-Str. 1 30625 Hannover

Principal investigator: Tel.: Project number: Volume: Funding period:

Dr. Bernhard Schiedlmeier +49 511 532-5134 01GN0930 448.951 EUR 01.04.2009 - 31.03.2012

The goal of subproject 1 is to establish efficient, reliable and safe Standard Operating Procedures (SOPs) for clinical grade ex vivo expansion of HSC derived from cord blood (CB-HSC). We will implement the inhibition of negative acting signaling pathways by applying novel principles of transient expression of genes and/ or delivery of proteins together with the advent of a novel, Angiopoietin-like 5 containing cytokine cocktail (“Zhang cocktail”). Further, transcriptional programs associated with HSC expansion common to both extrinsic (”Zhang cocktail") and intrinsic stimuli (HOXB4) will be determined to identify general mechanisms underlying HSC fate decisions in vitro and to define intercellular networks between stem cells and their progeny forming their in vitro niche. In subproject 5 we will subsequently apply CB-HSC, expanded ex vivo according to the SOPs developed by the CB-HERMES consortium, for the treatment of elderly patients (> 60 years) with high-risk AML. The CB-CD34+ cell fraction containing hematopoietic stem and progenitor cells (HPC) will be cultured ex vivo up to 20 days under serum/stroma-free conditions in the presence of SCF, TPO, FGF1, IGFBP2 and Angiopoietin-like 5 (“Zhang cocktail”). Genes mediating inhibition of TNF/Fas ligand- or TGF/Activin/BMP- signaling will be delivered using retroviral pseudotransduction (transfer of mRNA or proteins), episomal lentiviral vectors and integrating lentiviral vectors as a control for proof-of principle. The functional consequences of pathway inhibition and/or ex vivo expansion culture will be assessed by various in vitro assays (multilineage CFC assay, hematopoietic cell differentiation assays generating lymphoid, myeloid and erythroid cells). Transplantation into irradiated primary and secondary NOD/SCID-c recipient mice will allow to investigate in vivo the engraftment potential and self-renewal capacity of newly generated HSC as well as their frequency. Milestones of subproject 1 are to: 1) exploit HOXB4’s mechanisms of action to increase engraftment of expanded CB-HSC, by transient interference with negative acting cytokine pathways (TNF,TGF) on top of the use of a novel, growth factor combination containing Angiopoietin-like 5 (“Zhang cocktail”). 2) define pathways common to ex vivo HSC expansion by Angiopoietin-like 5 and HOXB4. 3) develop clinically applicable SOPs for CB-HSC (Lin-/CD34+/CD38- cells) using novel cytokine cocktails containing Angiopoietin-like 5. Milestones of subproject 5 are to: 1) The development of a clinical study protocol for the use of expanded CB-HSC in elderly patients (>60 years) with high-risk AML. 2) Comparing the kinetics of hematopoietic recovery to age-matched patients receiving peripheral blood or marrow HSC from matched unrelated donors. 3) Analyzing the incidence, severity and organ distribution of acute and chronic GvHD using proteome analysis of urine samples as tool for early detection  and intervention 4) Analyzing the fate of expanded and transplanted CB-HSC in the host. The research of subproject 1 is expected to develop clinically applicable SOPs that allow efficient HSC expansion ex vivo to provide allogeneic cell grafts for cellular replacement therapy. The experiments will also elucidate general molecular mechanisms associated with HSC expansion in vitro that will open new perspectives for the rational design of further improved expansion protocols. Subproject 1 will set the stage for realizing the research goals of subproject 5, the clinical transplantation of expanded CB-HSC in elderly patients with high-risk AML. The successful implementation of these projects may establish the basis for other clinically useful protocols using expanded HSC, with or without genetic modification. The results of subprojects 1&5 will be compared with other strategies for expansion of HSC within the CB-HERMES consortium, will be patented when possible, presented at scientific meetings and published in international peer-reviewed journals.

b) abgeschlossene Vorhaben