Teilprojekt eines Verbundes

Identifizierung von kausalen Krankheitsgenen und Signalwegen durch systematische und personalisierte genetische Interaktionskartierung

Förderkennzeichen: 01ZX1405B
Fördersumme: 629.700 EUR
Förderzeitraum: 2014 - 2018
Projektleitung: Dr. Fabiana Perocchi
Adresse: Helmholtz Zentrum München, Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH), Institut für Humangenetik (IHG)
Ingolstädter Landstr. 1
85764 Neuherberg

In diesem Teilprojekt wird ein genomweites, unverfälschtes, genetisches Screening an Fibroblasten aufgebaut, die von Patientinnen und Patienten mit Beeinträchtigungen der oxidativen Phosporylierung und der mitochondrialen Atmungskette stammen. Hierzu soll ein "pooled" RNAi-basierter Ansatz eingesetzt werden, bei dem die Zellkulturen gleichzeitig mit Hunderten oder Tausenden von unterschiedlichen kurzen Haarnadel-RNAs behandelt werden, wodurch die Auswirkungen des genetische Knock-downs parallel bestimmt werden kann. Da dieser Ansatz relativ neu ist, werden zunächst die experimentellen Protokolle und Versuchsbedingungen an humanen Fibroblasten als Kontrollzelllinien optimiert, wobei der mitochondriale Metabolismus durch die Anzucht auf nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquellen induziert wird. Mit der etablierten Versuchsreihe kann anschließend der pooled RNAi-Screen auf zehn humane primäre Fibroblasten-Zelllinien von gesunden Menschen und 40 humane primäre Fibroblasten-Zelllinien von Patientinnen und Patienten mit unbekannten genetischen Fehlern ausgeweitet werden. So können Gene für weitere Untersuchungen selektiert werden, deren Knockdown eine verbesserte Fitness des Mitochondrien-abhängigen Metabolismus aufweisen. Die funktionale Rolle von neu-identifizierten, epistatischen Interaktionen werden über quantitative PCR und Komplementationsversuche validiert. Gene mit besonderer Relevanz können letztlich für eine gezielte und detaillierte Bestimmung der mitochondrialen physiologischen und bioenergetischen Eigenschaften ausgewählt werden.