Optimierung der Probenprozessierung und PCR-Bedingungen der Immungen PCR für die automatisierte droplet Mikrofluidik und anschließende Hochdurchsatzsequenzierung.

Förderkennzeichen: 01KT1908B
Fördersumme: 269.967 EUR
Förderzeitraum: 2019 - 2022
Projektleitung: PhD Michaela Kotrová
Adresse: Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Med. Fakultät, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Klinik für Innere Medizin II, Hämatologie und Onkologie
Arnold-Heller Str. 3, Haus 50
24105 Kiel

Die Quantifizierung der minimalen Resterkrankung (MRD) gilt als wichtigster Prognosefaktor bei akuter lymphatischer Leukämie (ALL), als hochspezifischer MRD-Marker werden klonale Immunglobulin (IG) und T-Zell-Rezeptor (TR)-Genumlagerungen der ALL verwendet. Die zunehmende Verfügbarkeit der Hochdurchsatzsequenzierung (Next Generation Sequencing, NGS) eröffnet neue Möglichkeiten einer noch sensitiveren und spezifischeren MRD-Erfassung. Der Nachteil bisher publizierter NGS-MRD- Methoden besteht darin, dass die Reaktionen der für die Probenvorbereitung eingesetzten multiplex PCR unterschiedlich effizient ablaufen, welches eine korrekte Quantifizierung behindert. Zudem stellt Kontamination von Laboren durch PCR Produkt, welches zu falsch positiven Ergebnissen führen kann, ein ernstes Problem dar. Das Ziel von Quant-ALL besteht darin, diese Nachteile im Stand der Technik durch folgende Schritte zu beseitigen: 1) Erweiterung des Amplikon basierenden IGH-NGS-Ansatzes durch DNA-Barcoding Verfahren welche eine Rückrechnung der ursprünglich in der Probe vorhandenen Anzahl von IGH-Umlagerungen ermöglichen. 2) Erweiterung vorhandener Bioinformatik-Tools. 3) Übertragung dieser Technologie auf eine bereits vorhandene zentrifugalmikrofluidische Plattform zur vollständigen Automatisierung und Standardisierung. 4) Validierung der Technologie für Kinder und Erwachsenen ALL unter Verwendung von Biobank-Proben. Der Projektpartner UKSH etabliert und validiert in diesem Zusammenhang die primären IGHAssays, die anschließend von den anderen Projektpartnern auf die Mikrofluidik-Plattform übertragen und automatisiert werden sollen. Grundlage der Assays bilden IGH-NGS Methoden, die im Rahmen des Europäischen EuroClonality NGS Konsortiums entwickelt wurden.