Verbund

Imprintingerkrankungen - Klinisches Spektrum und pathogenetische Mechanismen

In dem Verbund "Imprinting" soll das klinische und molekulargenetische Spektrum von Imprintingerkrankungen bestimmt werden. Genomisches Imprinting bezeichnet einen epigenetischen Prozess, bei dem in der männlichen oder weiblichen Keimbahn unterschiedliche Gene durch DNA-Methylierung stillgelegt werden, so dass nach der Befruchtung nur das mütterliche oder väterliche Allel dieser Gene aktiv ist. Der Funktionsverlust des einen aktiven Allels oder die Verdopplung seiner Dosis durch genetische oder epigenetische Mechanismen führt zu spezifischen Erkrankungen wie dem Prader-Willi-Syndrom (PWS), dem Angelman-Syndrom (AS), dem Beckwith-Wiedemann-Syndrom (BWS), dem Silver-Russel-Syndrom (SRS), dem Transienten Neonatalen Diabetes Mellitus (TNDM) und den upd(14)-Syndromen. Ein Schwerpunkt der Untersuchungen in diesem Verbund liegt auf Imprintingfehlern, die bei der Imprintauslöschung, -etablierung oder -erhaltung aufgetreten sind. Hierbei handelt es sich meistens um primäre Epimutationen, also epigenetischen Veränderungen ohne Veränderung der DNA-Sequenz. Teilziele des Vorhabens sind die

• Identifikation neuer Mikrodeletionen/-duplikationen geprägter Regionen
• Identifikation neuer Imprinting-Center-Mutationen
• Bestimmung der Häufigkeit multipler Imprintingfehler
• Identifikation genetischer Varianten, die das Imprinting in trans beeinflussen
• Identifikation neuer Imprintingerkrankungen
• Bestimmung des phänotypischen Spektrums von Imprintingerkrankungen
• Verbesserung der genetischen Diagnostik und Beratung

Koordinator:
Prof. Dr. Bernhard Horsthemke
Universität Duisburg-Essen
Universitätsklinikum Essen
Institut für Humangenetik
Hufelandstr. 55
45147 Essen
Tel.: 0201 723-4560
Fax: 0201 723-5900
E-Mail: bernhard.horsthemke@uni-due.de
Internet: http://www.uni-due.de/zmb/members/horsthemke/overview.shtml

Teilprojekte

Abgeschlossen

Teilprojekte 1, 2

Förderkennzeichen: 01GM1513A
Gesamte Fördersumme: 506.720 EUR
Förderzeitraum: 2015 - 2018
Projektleitung: Prof. Dr. Bernhard Horsthemke
Adresse: Universität Duisburg-Essen, Universitätsklinikum Essen, Institut für Humangenetik
Hufelandstr. 55
45147 Essen

Teilprojekte 1, 2

Das Teilprojekt 1 dient der Koordination des Konsortiums. In dem Teilprojekt wird die Zusammenarbeit der Projekte koordiniert, die Patientendatenbank gepflegt und bioinformatische und statistische Analysen, z.T. mit neu zu entwickelnden Algorithmen durchgeführt. Im Teilprojekt 2 werden Patienten mit bekannten Imprintingerkrankungen im Detail untersucht. Zur Identifizierung von Imprinting-Center-Mutationen, die das genomische Imprinting beeinflussen, sollen mittels hoch-paralleler Sequenzierung die entsprechenden Regionen für Angelman-Syndrom, Beckwith-Wiedemann-Syndrom, Silver-Russell-Syndrom, upd(14)-Syndrome und Transienten Neonatalen Diabetes Mellitus sequenziert werden. Durch eine Exom-Sequenzierung sollen trans-wirkende Gene identifiziert werden. Diese Untersuchung wird an Patienten mit Angelman-Syndrom mit und ohne somatisches Mosaik für einen Imprintingdefekt, an Patienten mit Beckwith-Wiedemann- oder Silver-Russell-Syndrom und Multimethylierungsdefekten und in einer Familie mit rekurrenten Imprintingdefekten der Imprintingkontrollregion 2 auf Chromosom 11p15 durchgeführt. Weiterhin soll über einen Vergleich von Expressionsprofilen die molekulare Grundlage von gemeinsamen klinischen Merkmalen bei Prader-Willi- und upd(14)mat-Syndrom identifiziert werden. Folgende Arbeitsschritte sind geplant: Rekrutierung von Patienten mit PWS, AS, BWS, SRS oder upd(14)-Syndrom und einem Imprinting-Defekt. Klinische Evaluation und molekulargenetische Klassifizierung (Monat 1-36).  Methylierungsanalyse mittels hochparalleler Sequenzierung an Bisulfit-behandelter DNA für das gesamte Netzwerk (Monat 1-36).  Sequenzierung der IC-Regionen und Exome durch hochparallele Sequenzierung (Monat 1-30).  RNAseq an Fibroblasten und IPSCs von PWS und upd(14)mat-Syndrom (Monat 18-36).

Abgeschlossen

Teilprojekt 3a

Förderkennzeichen: 01GM1513B
Gesamte Fördersumme: 263.340 EUR
Förderzeitraum: 2015 - 2018
Projektleitung: Prof. Dr. Thomas Eggermann
Adresse: Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, Fakultät 10 - Medizin und Universitätsklinikum, Institut für Humangenetik
Pauwelsstr. 30
52074 Aachen

Teilprojekt 3a

In diesem Vorhaben wird Teilprojekt 3a bearbeitet: Molekulare Veränderungen in der chromosomalen Region 11p15.5d führen entweder zum Silver-Russell- oder zum Beckwith-Wiedemann-Syndrom (SRS, BWS). Dabei werden fortlaufend neue Mutationen und Epimutationen bei Patienten identifiziert, so dass das molekulare Spektrum derzeit noch nicht vollständig erfasst ist. Die bisherigen Arbeiten der Projekteilnehmer haben gezeigt, dass bei den beiden Erkrankungen, aber auch den anderen Imprintingerkrankungen, nicht nur spezifische Genorte betroffen sind, sondern auch allgemeine Methylierungsstörungen auftreten können. Die funktionellen Konsequenzen der einzelnen, aber auch der allgemeinen Störungen sind derzeit meist unklar. Die Charakterisierung dieser molekularer Veränderungen und die Identifizierung neuer Befunde bei SRS und BWS ist daher nicht nur die Grundlage für das Verständnis ihrer Pathoätiologie, sie ist auch Voraussetzung für eine effiziente Diagnostik und neue personalisierte Therapieansätze. Im geplanten Projekt sollen daher zum einen die diagnostischen Algorithmen verbessert werden, mit ihrer Hilfe sollen dann weitere Patienten charakterisiert und bisher unbekannte molekulare Defekte und ihre Interaktionen identifiziert werden. Folgende Arbeitsschritte sind geplant: Erfassung von Patienten mit ungewöhnlichen/neuen molekularen Veränderungen, Entwicklung und Validierung eines Multilocus-MS-MLPA-Ansatzes; Entwicklung eines zielgerichteten MS-NGS-Ansatzes; NGS-Verfahren bei Patienten mit 11p15-Imbalancen und ICR1-Hypomethylierung.

Abgeschlossen

Teilprojekt 3b

Förderkennzeichen: 01GM1513C
Gesamte Fördersumme: 143.545 EUR
Förderzeitraum: 2015 - 2018
Projektleitung: Dr. Dirk Prawitt
Adresse: Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Kinderklinik und Kinderpoliklinik - Molekulargenetisches Labor
Obere Zahlbacher Str. 63
55131 Mainz

Teilprojekt 3b

Die mit der chromosomalen Region 11p15.5-assoziierten Imprinting-Erkrankungen (IDs) Beckwith-Wiedemann Syndrom (BWS) und Silver-Russell Syndrom (SRS) sind charakterisiert durch komplexe Wachstumsdefekte mit variablem klinischen Bild. Die zur Zeit verwendeten diagnostischen Vorgehensweisen lassen aufgrund niedrig-mosaikaler epigenetischer Defekte, derzeit unbekannten genetischen Veränderungen regulatorischer Bereiche in 11p15.5 sowie in weiteren chromosomalen Regionen eine erhebliche Anzahl der Patienten ohne molekulare Diagnose. Im Teilprojekt 3 soll daher der vorhandene diagnostische Algorithmus weiter ausgeweitet und optimiert werden. Mit dem Teilprojekt 3b soll dadurch gleichzeitig herausgefunden werden, wie sich gefundene Veränderungen funktionell auf die Transkription geprägter Gene auswirken, bzw. wie sie sich gegenseitig beeinflussen. Sowohl die Identifizierung der molekularen Veränderungen bei SRS und BWS als auch deren funktionelle Charakterisierung ist die Grundlage für das Verständnis der Pathoätiologie und Voraussetzung für eine effiziente Diagnostik sowie neue personalisierte Therapieansätze. Arbeitsschritte sind: Erfassung von Patienten mit ungewöhnlichen/neuen molekularen Veränderungen; Analyse deregulierter geprägter Gene bei Imprintingerkrankungen mit MLID Potenzial; Funktionelle Analysen von (Epi)-Mutationen, die mittels der in Aachen (TP3a) etablierten NGS-Ansätze identifiziert wurden; Nachweis von trans-Effekten von Schlüssel-Faktoren.

Abgeschlossen

Teilprojekte 4, 5

Förderkennzeichen: 01GM1513D
Gesamte Fördersumme: 501.637 EUR
Förderzeitraum: 2015 - 2018
Projektleitung: Prof. Dr. Reiner Siebert
Adresse: Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel - Institut für Humangenetik
Arnold-Heller-Str. 3, Haus 10
24105 Kiel

Teilprojekte 4, 5

Teilprojekt 4 sammelt Proben von Patienten mit Störungen der elterlichen Prägung (Imprinting) an mehreren Genen. Um die Bedeutung der beiden häufig von Prägungsstörungen betroffenen Gene ZDBF2/GPR1 und FAM50B für Patienten mit mehrfachen Imprinting-Störungen zu untersuchen, werden bis zu 500 Patienten analysiert. Zudem stellt Teilprojekt 4 dem Konsortium technische Plattformen für (epi)genetische Analysen zur Verfügung. Als Grundlage zur epigenetischen Charakterisierung von Imprinting-Störungen wird von bis zu fünf Patienten mit Imprinting-Störungen die Struktur der DNA und der mit ihr assoziierten Proteine sowie die Interaktion des Proteins CTCF mit der DNA in verschiedenen Geweben (z. B. Blut-, Haut- und pluripotente Stammzellen) nach den Standards des Internationalen Epigenom Projektes katalogisiert. Teilprojekt 5 verfolgt einen therapeutischen Ansatz mit dem Ziel, Imprinting-Störungen direkt mittels einer gerichteten Modifikation der DNA-Methylierung zu korrigieren. Grundlage hierfür sind die bereits etablierten Stammzellen von Patienten mit Imprinting-Störungen. Es sollen Proteine (CRISPR/cas9 Komplexe) an spezielle Enzyme gekoppelt werden und in diese Zellen transfiziert werden. Durch die Korrektur des fehlerhaften Methylierungsmusters von Patienten mit Imprinting-Störungen in Zellkulturen sollen innovative Ansätze zur Behandlung bisher unheilbarer epigenetischer Erkrankungen erarbeitet werden. Arbeitsschritte sind: Klinische und molekulare Charakterisierung von Patienten mit MLID/MLID+; Evaluierung von Imprinting-Störungen unter Beteiligung der ZBDF2/GPR1 und FAM50B loci; Chromatin Analysen; Konstruktion von CRISPR/Cas9 Konstrukten und guideRNAs; CRISPR/Cas9 gekoppelte Methylierung in Zelllinien; Transfektion-Optimierung; Transfektion und Methylierungsanalyse; Analyse der Expressions- und Epigenomveränderungen; Analyse von iPSC abgeleiteten Zellen.

 

Abgeschlossen

Teilprojekt 4

Förderkennzeichen: 01GM1513F
Gesamte Fördersumme: 245.945 EUR
Förderzeitraum: 2016 - 2018
Projektleitung: Prof. Dr. Reiner Siebert
Adresse: Universität Ulm, Universitätsklinikum Ulm, Institut für Humangenetik
Albert-Einstein-Allee 11
89081 Ulm

Teilprojekt 4

Teilprojekt 4 sammelt Proben von Patienten mit Störungen der elterlichen Prägung (Imprinting) an mehreren Genen. Um die Bedeutung der beiden häufig von Prägungsstörungen betroffenen Gene ZDBF2/GPR1 und FAM50B für Patienten mit mehrfachen Imprinting-Störungen zu untersuchen, werden bis zu 500 Patienten analysiert. Zudem stellt Teilprojekt 4 dem Konsortium technische Plattformen für (epi)genetische Analysen zur Verfügung (Array- und Sequenzierungs-basierte Verfahren). Als Grundlage zur epigenetischen Charakterisierung von Imprinting-Störungen wird von bis zu fünf Patienten mit Imprinting-Störungen die Struktur der DNA und der mit ihr assoziierten Proteine (Chromatinstruktur und bis zu 6 Histonmodifikationen) sowie die Interaktion des Proteins CTCF mit der DNA in verschiedenen Geweben (z.B. Blut-, Haut- und pluripotente Stammzellen) nach den Standards des Internationalen Epigenom Projektes katalogisiert. Folgende Arbeitspakete werden bearbeitet: Arbeitspaket 4.1: Klinische und molekulare Charakterisierung von Patienten mit MLID/MLID+; Abeitspaket 4.2: Evaluierung von Imprinting-Störungen unter Beteiligung der ZBDF2/GPR1 und FAM50B loci und Arbeitspaket 4.3: Chromatin Analysen.

 

Abgeschlossen

Teilprojekt 5

Förderkennzeichen: 01GM1513E
Gesamte Fördersumme: 263.340 EUR
Förderzeitraum: 2015 - 2018
Projektleitung: Prof. Albert Jeltsch
Adresse: Universität Stuttgart, Fakultät 3 Chemie, Institut für Biochemie
Pfaffenwaldring 55
70569 Stuttgart

Teilprojekt 5

Ziel dieses Projekts ist es, die fehlerhafte DNA-Methylierung bei Imprintingerkrankungen zu korrigieren. Hierzu werden sogenannte DNA-Methyltransferasen eingesetzt, Enzyme die Methylgruppen auf die DNA übertragen. Diese sollen durch Zinkfingerproteine gezielt an die DNA-Stellen im Genom gebracht werden, an denen die DNA-Methylierung korrigiert werden muss. Solche Zinkfingerproteine sollen eingesetzt werden, weil ihre DNA-Bindungsspezifität artifiziell entwickelt werden kann. Es werden im Zuge des Projekts Zinkfingerproteine erzeugt, die spezifisch an den Prader/Willi- und Angelmann Syndrom Locus binden. Die Bindung wird präferentiell an die DNA-Sequenzen gerichtet, in denen der DNA-Methylierungsdefekt bei Patienten mit Imprintingerkrankungen auftritt. Falls die Adressierung an den Prader/Willi- und Angelmann Syndrom Locus nicht erfolgreich ist, soll alternativ wird auch mit dem Beckwith/Wiedemann- und Silver/Russel-Syndrom Locus gearbeitet werden. Die Bindung der Zinkfingerproteine an die Zielregionen soll verifiziert werden. Dafür kommt eine als Chromatin Immunpräzipitätionsexperiment bezeichnete Methode zum Einsatz, die es erlaubt, die Bindung von Proteinen an DNA genomweit zu untersuchen. Die so hergestellten Zinkfingerproteine werden anschließend mit DNA-Methyltransferasen fusioniert, um die Zielregionen zu methylieren und damit den Methylierungsdefekt zu korrigieren. Um die Zinkfingerprotein-Methyltransferase Konstrukte in Zellen einzubringen, werden verschiedene Methoden erprobt. Anschließend werden die Änderungen der DNA-Methylierung in beiden Allelen unter Verwendung der Ressourcen des Konsortiums untersucht. Bei erfolgreicher Methylierung der Zielregionen wird die allelspezifische Genexpression der entsprechenden geprägten Gene analysiert.